一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，属于微生物学领域。
【背景技术】
[0002] 植物内生菌（Endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健 康植物内部，而不引起宿主植物明显症状的菌，可以通过组织学方法或从严格表面消毒的 植物组织中分离出来，也可以通过扩增出其DNA的方法证明其存在。植物内生菌是植物 微生态系统的天然组成部分，包括内生真菌（Endophtyic fungi)和内生细菌（Endophtic bacteria)。内生真菌与植物在长期进化过程中形成一种共生或互生的关系，即内生真菌从 宿主汲取生存的养分，同时又在宿主植物的生长发育和抗外界侵袭方面做出贡献，甚至可 以间接影响宿主植物的生态地位和系统演化过程。有研究显示，感染内生真菌的植物往往 具有生长快、耐受性强和抗病虫害等优势，同时内生真菌还能增加宿主植物次生代谢的生 成量。
[0003] 烟草内生真菌是与烟草有互利共生关系的生态类群，是烟 田微生物群落的重要成员。烟草内生真菌不仅能促进烟草生长，增强抗病虫能力，还具有降 低烟草亚硝胺含量，改善烟叶品质的积极作用。因此，烟草内生真菌的研究及开发对阐明烟 草内生真菌的种类、分布特点，提尚烟叶品质具有重要意义。
[0004] 现有关于植物内生真菌的文献报道主要集中在医药方向和农业方向，尤其是以生 物医药开发为目标的药用植物内生真菌方面，但是存在"初步研究多，深入追究少"的特点。 目前关于烟草内生真菌的研究报道相对较少，缺乏统一的分离、培养与鉴定体系，而且大多 数停留在功能筛选上，对分离培养的内生真菌从比较全面、深入的角度进行分类学研究较 少。因此，建立并完善烟草内生真菌的分离、培养与鉴定体系有助于提供烟草内生真菌与烟 草之间相互作用关系及其生物功能的新信息，为系统剖析烟草内生菌的多样性与功能性提 供理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是基于上述现状而提供的一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方 法，从新鲜烟叶中分离、培养并鉴定烟草内生真菌，去除非生物杂质，尽可能完整的保存烟 草内生真菌的多样性，是进行烟草内生真菌研究的前提。
[0006] 为实现上述目的，本发明涉及一种快速分离、纯化与鉴定新鲜烟叶中内生真菌的 方法，主要包括烟叶表面消毒、切片培养、菌丝的分离纯化、菌丝DNA的提取、PCR扩增真菌 的ITS-rDNA基因、PCR目的片段的测序、序列的比对鉴定等步骤，具体步骤如下： (1)用无菌水浸泡新鲜烟叶并洗涤，除去烟叶表面杂质。
[0007] (2)将步骤1中处理烟叶用75%乙醇浸泡消毒2~3 min，并用无菌水洗涤（2~3 次）除去乙醇。
[0008] (3)检验步骤2中消毒是否彻底：取最后一次清洗烟叶上乙醇的无菌水，利用涂布 法涂平板培养，看是否有杂菌长出。若有无杂菌长出则消毒彻底；若有杂菌长出，则消毒不 彻底，需重复消毒。
[0009] (4)将步骤2中烟叶去除叶片边缘，切成0. 5X0. 5 cm小块放入培养基中培养。培 养基组成为：葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，琼脂15~20 g/L，20~30万 单位/L的青霉素。。
[0010] (5 )将步骤4中的烟叶与培养基放入培养箱，25 °C恒温培养。
[0011] (6)观察步骤5中烟草内生菌生长状态，待切口处长出菌丝后，将菌丝在新鲜培养 基中利用平板划线法进一步纯化，连续分离3~5次即可得到表面形态一致的烟草内生真 菌。
[0012] (7)观察记录步骤6中获得的烟草内生真菌菌落形态，并对菌株编号。将一部分纯 化的菌丝在无菌条件下利用接种针挑入已灭菌的20%甘油水溶液中，-20°C保存留种；另一 部分冷冻干燥后备用。
[0013] (8)取0.1 g步骤7中冷冻干燥后的菌丝放入预先加入液氮的研钵中，充分研磨， 再转移到1.5 mL Eppendorf管中，加入0.1 mL 10%的SDS、0. 3 mL氯化苄，剧烈振荡使之 成乳状。
[0014] (9)在50°C水浴锅中保温I h，每隔10 min振荡混合1次。
[0015] (10)加入 0.3 mL 3 mol/L NaAc (ρΗ5· 2)，冰水浴 15 min，4°C 下 12000 r/min 离 心10 min，取上清液至一个已灭菌的新Eppendorf管中。
[0016] (11)加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1)和苯酚，其中氯仿-异戊醇和苯酚体积各 半，振荡摇勾。4°C下12000 r/min离心10 min，取上清至另一个已灭菌的新Eppendorf管 中。
[0017] (12)重复步骤11，然后加入1/10体积的3 mol/L NaAC和等体积的预冷的异丙醇， 轻轻上下混匀，可见有絮状沉淀析出。置入-20°C冰箱15~17 h，使DNA充分沉淀。
[0018] (13)4°C下12000 r/min离心10 min，收集沉淀，加入75%预冷的乙醇洗涤沉淀两 次。
[0019] (14)吸除乙醇，在通风橱中干燥10~15 min。加入30~50 μ L TE缓冲液溶解 DNA，-20°C保存备用。
[0020] (15)利用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
[0021] (16)以提取的DNA为模板，PCR扩增真菌的ITS-rDNA基因。PCR反应体系如下（以 50 μL反应体系为例）：
PCR反应条件为：94°C预变性5 min;94°C变性30 s，65°C退火30 s，72°C延伸45 s，共 运行30~35个循环；最后72°C延伸10 min ;4°C保存。
[0022] 如果PCR扩增出特异性目的条带，将该目的条带胶回收，与T载体连接，转化感受 态细胞，随机挑取单克隆进行测序。
[0023] (17)将所测序列在NCBI上进行Blast序列比对，对烟草内生真菌进行鉴定。
[0024] 本发明的特点和意义在于：建立并完善烟草内生真菌的分离、培养与鉴定体系，有 助于提供烟草内生真菌与烟草之间相互作用关系及其生物功能的新信息，为系统剖析烟草 内生菌的多样性与功能性提供理论依据。本发明的提出对于烟草内生真菌的研究及开发、 阐明烟草内生真菌的种类、分布特点，提高烟叶品质具有重要意义。
【附图说明】
[0025] 图1为烟草内生真菌分离过程示意图； 图2为烟草内生真菌PCR扩增结果，图中1.实验组，2.阴性对照，M. DL2000 DNA Marker ； 图3为Blast序列比对结果，+Identities :序列相似度：99%。
[0026] 具体实施案例 下面结合附图和具体实例对本发明做进一步的详细说明。
[0027] -种快速分离、纯化与鉴定新鲜烟叶中内生真菌的方法，具体步骤如下： (1)采集旺长期新鲜烟叶，无菌水洗干净，75%乙醇浸泡消毒3 min，无菌水冲洗3次，去 除乙醇，并取最后一次的无菌水进行无菌检验。
[0028] (2)去除烟叶边缘，切成0.5X0. 5 cm小块，放入培养基(葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，琼脂15~20 g/L，青霉素25万单位/L)中培养。待切口处长出菌丝， 通过平板划线法在新鲜培养基上连续分离纯化3次，得到表面形态一致的内生菌。
[0029] (3)观察记录菌落形态，对菌株编号。将一部分纯化的菌丝在无