一种悬浮培养bhk-21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种悬浮培养BHK-21细胞的无血清无 动物源培养基及其配制方法。
【背景技术】
[0002] BHK-21细胞系即叙利亚仓鼠肾细胞，英文名称：Baby Hamster Kidney Cell，1961 年英国人I. A. Macpherson和M. G. P Stocker用1日龄叙利亚仓鼠的肾建立的传代细胞，常 用的是克隆13,是由5只一日龄，性别特征不是特别明显的肾细胞而来，即：BHK-21C13,中 文全名为：叙利亚仓鼠肾细胞克隆13,以下简称BHK-21细胞。BHK-21细胞是世界卫生组织 和中国生物制品规程认可的生产疫苗的细胞系，可以用于多种病毒的增殖和纯化，如口蹄 疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV)，脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV)，呼肠孤病毒（Reovirus)，水疱性口 炎病毒（Vesicular stomatitis virus， VSV)等。由于它生长速度较快、病毒敏感谱广、对大量制备病毒疫苗有利，研究人员经无数 次传代驯化，使它可悬浮生长并用于病毒性疫苗的生产，如口蹄疫疫苗，狂犬病疫苗，乙脑 疫苗等。
[0003] 目前采用BHK-21细胞的疫苗生产中，无血清悬浮培养是最为先进的工艺。无血清 培养基相比有血清培养基具有诸多优势：1)可克服血清批次间的差异性，使细胞培养性能 更加稳定，能提高结果的重复性；2)可避免血清的外源性污染，因为动物来源血清常携带 病毒或支原体；3)可简化下游目的产物的分离纯化，节省成本；4)成分相对明确，有利于研 究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等一系列细胞行为。
[0004] 目前，国外的无血清培养基产品价格高且配方保密，同时国内外均缺少专门针 对BHK细胞培养的无血清培养基，而且培养基性能较差，例如中国内2014年公布的最新 专利CN103555658A，其发明的BHK-21无血清悬浮培养基，以50*10 4cells/ml接种，24小 时后仅能达到150*104cellS/ml，细胞增殖速度缓慢，倍增时间较长，96小时后仅能达到 500*10 4cells/ml，所能支持细胞生长的密度较低。中国内的培养基龙头企业北京清大天一 生物技术有限公司开发出可以悬浮培养BHK细胞的低血清培养基，根据其细胞手册2011版 显示，即使清大天一生物技术有限公司的低血清培养基，悬浮培养BHK-21细胞的密度也仅 仅达到了 400*104cells/ml。综上所述，开发低成本、支持细胞快速增殖和高密度悬浮培养 的BHK-21细胞无血清培养基对国内动物疫苗行业的发展具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于，克服现有技术中的缺陷，提供一种针对中国工业生产所用 BHK-21细胞的生长的特点，研制适合BHK-21细胞高密度悬浮培养的低成本无血清无动物 源低蛋白培养基。通过添加脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等组分来替代血清 的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基 组分的优化，使BHK-21细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更 适合于规模化工业生产。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种促进悬浮培养BHK-21 细胞快速增殖的无血清无动物源培养基，其特征在于：包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水 解物，脂类和添加物；
[0007] 所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬氨酸、L-天冬 酰胺、L-半胱氨酸一水合物、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋 氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐、L-缬氨 酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸和甘氨酸；
[0008] 所述无机盐包括无水氯化钙、氯化钠、磷酸氢二钠、六水氯化镁、无水硫酸镁、氯化 钾、一水磷酸二氢钠、七水合硫酸锌、九水合硝酸铁、亚硒酸钠、五水硫酸铜和硫酸亚铁；
[0009] 所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、磷酸吡 哆醛、核黄素、钴胺素、盐酸硫胺素和肌醇；
[0010] 所述蛋白水解物包括酵母超滤物、棉籽水解物、大米水解物和麦麸水解物；
[0011] 所述脂类包括亚油酸、大豆卵磷脂、胆固醇、腐胺和乙醇胺；
[0012] 所述添加物包括D-葡萄糖、丙酮酸钠、硫辛酸、胸苷、腺嘌呤、胸腺嚓咤、重组胰岛 素、柠檬酸铁、环庚三烯酚酮、酚红钠盐、F-68、碳酸氢钠、还原型谷胱甘肽和次黄嘌呤钠盐。
[0013] 进一步，一种悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基，其特征在于，所述 培养基中包括下列含量的原料物质：
[0014] (1)氨基酸：
[0015] L-丙氨酸 100-180mg/L，
[0016] L-谷氨酰胺 2〇0_3〇Omg/L，
[0017] L-精氨酸盐酸盐 200-300mg/L，
[0018] L-天冬氨酸 100_150mg/L，
[0019] L-天冬酰胺 3〇〇-45〇mg/L，
[0020] L-半胱氨酸一水合物10-50mg/L，
[0021] L-谷氨酸 5O-I5Omg/!,
[0022] L-异亮氨酸 100_3〇Omg/L，
[0023] L-亮氨酸 100_150mg/L，
[0024] L-赖氨酸盐酸盐 100_350mg/L，
[0025] L-蛋氨酸 35_9〇mg/L，
[0026] L-苯丙氨酸 10_60mg/L，
[0027] L-脯氨酸 80_155mg/L，
[0028] L-丝氨酸 100_200mg/L，
[0029] L-苏氨酸 l5〇_25〇mg/L，
[0030] L-色氨酸 100_150mg/L，
[0031] L-酪氨酸二钠盐 30-100mg/L，
[0032] L-缬氨酸 100_185mg/L，
[0033] L-胱氨酸盐酸盐50_85mg/L，
[0034] L-组氨酸盐酸盐 50_150mg/L，
[0035] L-赖氨酸 5〇_5〇Omg/L,
[0036] 甘氨酸 50_90mg/L，
[0037] (2)无机盐：
[0038] 无水氯化钙 100_150mg/L，
[0039] 氯化钠 5〇00_75〇Omg/L，
[0040] 磷酸氢二钠 10_45mg/L，
[0041] 六水氯化镁 50-80mg/L，
[0042] 无水硫酸镁2_65mg/L,
[0043] 氯化钾 40_35〇mg/L，
[0044] 一水磷酸二氢钠 20_50mg/L，
[0045] 七水合硫酸锌0· 1-0. 7mg/L，
[0046] 九水合硝酸铁 0· 01-0. 6mg/L，
[0047] 亚硒酸钠 0· 01-0. 〇3mg/L，
[0048] 五水硫酸铜 0· 0001-0. 003mg/L，
[0049] 硫酸亚铁 0· 01-0. 2mg/L，
[0050] ⑶维生素：
[0051] 生物素 0· 005-0. 01mg/L，
[0052] 维生素 Cl-12mg/L，
[0053] 氯化胆碱 0· 5_5mg/L，
[0054] D-泛酸钙 0· 2_2mg/L，
[0055] 叶酸 0· 2_5mg/L，
[0056] 烟酰胺 5_8mg/L，
[0057] 盐酸吡哆醇5_8mg/L，
[0058] 磷酸吡哆醛 0· 06-0. 3mg/L，
[0059] 核黄素 0· 08-0. 6mg/L，
[0060] 钴胺素 0· 04_3mg/L，
[0061] 盐酸硫胺素 0· 05-0. 5mg/L,
[0062] 肌醇 5_8mg/L，
[0063] (4)脂类：
[0064] 亚油酸 0· 1-0. 3mg/L,
[0065] 大豆卵磷脂 15_20mg/L,
[0066] 胆固醇 6-lOmg/L,
[0067] 腐胺 0· 04-0. 8mg/L，
[0068] 乙醇胺 l_30mg/L，
[0069] (5)水解物：
[0070] 棉籽水解物 500-4000mg/L，
[0071] 酵母超滤物 500-4000mg/L，
[0072] 大米水解物 500_2000mg/L，
[0073] 麦麸水解物 500_4000mg/L，
[0074] (6)其余添加物：
[0075] D-葡萄糖 3000_6000mg/L，
[0076] 丙酮酸钠 100_250mg/L，
[0077] 硫辛酸 0· 05-0. 6mg/L，
[0078] 胸苷 0· 06-0. 5mg/L，
[0079] 腺嘌呤 0· l-5mg/L，
[0080] 胸腺嘧啶 0· 02_2mg/L，
[0081] 重组胰岛素3-25mg/L，
[0082] 柠檬酸铁 0· 02-lmg/L，
[0083] 环庚三烯酉分酮0· l_8mg/L，
[0084] 酚红钠盐 6_l5mg/L，
[0085] F-6850_600mg/L，
[0086] 碳酸氢钠 1200_2200mg/L，
[0087] 还原型谷胱甘肽0· 01-0. 9mg/L，
[0088] 次黄嘌呤钠盐0· l_5mg/L。
[0089] 本发明的优点及有益效果是，本发明所述悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物 源培养基提供了一种低成本的适用于BHK-21细胞悬浮培养的无血清无动物源低蛋白培养 基，通过添加脂类、维生素、微量元素等成分，特别是通过添加四种水解物并予以优化，完全 替代了血清的功能，显著促进了细胞的增殖速度，并使细胞能保持较高的活力。
[0090] 本发明采用的另一个技术方案是一种上述悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物 源培养基的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括如下步骤：
[0091] 步骤1 :在容器中加注射用水至总体积的90 %，将权利要求1所述组分依次加入到 溶液中，轻微搅拌溶解；
[0092] 步骤2 :轻微搅拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100% ;
[0093] 步骤3 :用lmol/L氢氧化钠溶液或lmol/L盐酸溶液调节pH至7. 2 ;
[0094] 步骤4 :用0. 2 μ m滤膜正压过滤除菌；
[0095] 步骤5 :溶液配制完成后应在2°C~8°C下密闭避光保存。
[0096] 其中优选的技术方案是，所述步骤1步骤中注射用水的水温为25°C。
[0097] 本发明的优点及有益效果还有，BHK-21细胞在该发明无血清培养基中，细胞生长 增殖迅速，以80*10 4cells/ml的密度接种后，24小时细胞密度可以达到460*104cells/ml， 细胞倍增时间显著低于目前市售产品，48小时细胞密度可以达到688*10 4cellS/ml的高密 度，细胞活力始终保持95%以上，完全满足了高密度悬浮培养规模化工业生产的要求。
【附图说明】
[0098] 图1 :实施例2, BHK-21细胞在新发明无血清