分泌抗小麦黄花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应 用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV)是一种由禾谷多黏菌 (Polymyxa graminis L.)传播的麦类土传病毒，禾谷多黏菌是一种专性寄生于植物根部的 真核低等生物，该介体分布范围广，可在30多种禾谷类作物和杂草上寄生，且拥有抗逆性 很强的休眠孢子和完成侵染循环的游动孢子，只要条件适宜，即可激发游动孢子携带病毒 侵染寄主的根系，造成严重的病害。小麦黄花叶病由日本的Sawada在1927年首次发现并 描述，至今仍是麦类生产上的一种重要病害。在自然条件下WYMV常与中国小麦花叶病毒 (Chinese wheat mosaic virus，CffMV)复合侵染小麦，导致严重的田间病害，这两类病毒都 属于真菌传棒状病毒组，电镜下观察病毒粒子为直棒状二分体。
[0003] 小麦黄花叶病主要分布在日本、韩国和中国。我国目前主要分布于长江、黄河中下 游和淮河流域，包括四川、陕西、江苏、浙江、安徽、湖北、山东和河南等省，其中江苏省的里 下河地区和宁镇扬丘陵地区、湖北省东北沿大别山地区、陕西省渭河流域关中地区发生较 重。该病害已经成为我国冬小麦产区的一种重要的病毒病，对小麦的产量和品质有严重影 响。一般病田发病减产10%-30%，严重的达70%-80%，甚至绝收。田间小麦发病的典型 症状为叶片上产生黄色花叶，叶片褪绿，严重感病植株扭曲畸形，老病叶逐渐变黄枯死。一 般感病植株分蘖少、根系发育不良；重者明显矮化，扭曲畸形，分藥萎缩枯死，整株死亡。为 了监测和防控小麦黄花叶病的发生和扩散，急需建立该病害的高通量的检测方法。
[0004] 目前，对病害的检测方法主要有直接观察法、分子生物学法和血清学方法。症状观 察是判断田间发病情况的一种比较常用和直观的方法。但由于发病症状的相似性，隐症现 象，以及复合侵染的情况，所以这种方法一般情况下判断不够准确。RT-PCR的检测方法虽然 比较灵敏且特异性好，但由于它的花费成本大且仪器要求高，一般局限于实验室用。综合而 言，血清学方法操作简便、特异性好、灵敏度高且成本低，更适用于田间大规模样品的检测， 并易于在基层进行推广。WYMV的血清学检测方法是通过制备抗血清，利用ELISA或Western blot对病毒进行检测和研究。向荣等和韩成贵等分别制备了 WYMV Pl和CP的抗血清，可以 通过ELISA或Western blot等血清学手段检测病毒；尚巧霞等建立了 WYMV ELISA检测系 统。但这些以多抗建立的血清学方法未见其在田间样品大规模检测中应用的报道。因此本 研究利用提纯的WYMV病毒粒子为免疫原，经杂交瘤技术共获得了 1株能够高效分泌抗WYMV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，利用该杂交瘤细胞制备了腹水单抗。以制备的单抗为核心建 立了能准确可靠特异性地检测小麦中WYMV的ACP-ELISA、TAS-ELISA、dot-ELISA血清学方 法和免疫检测试剂盒，并成功应用于田间小麦黄花叶病毒的检测，为WYMV田间大规模快速 检测的实现提供了物质和技术支撑，从而推动了小麦黄花叶病的预报预警和科学防控体系 的建立。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗小麦黄花叶病毒（WYMV) 单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。
[0006] 分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F4,能分泌抗小麦黄花叶病 毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6F4于2014年12月25日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保 藏号为 CGMCC No. 10296 ;
[0007] 抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10 7,抗体类型及亚类为 IgG2b、kappa链，该单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该 单抗体检测病叶的灵敏度达到1 : 20480倍稀释。
[0008] 抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体仅与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国 小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水 稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜 花叶病毒、小西萌芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒反应。
[0009] 抗小麦黄花叶病毒（WYMV)单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为 核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
[0010] 本发明与现有技术相比具有的有益效果：
[0011] 1)提供的杂交瘤细胞株分泌抗小麦黄花叶病毒（WYMV)特异性单克隆抗体，以该 单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA和TAS-ELISA等免疫学方法能高度特 异、准确、灵敏的检测小麦黄花叶病毒；
[0012] 2)以本发明所制备的单克隆抗体为核心建立的检测小麦黄花叶病毒的各种 ELISA方法，既不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备，又可以一次性检测大量样品，不但 节约了检测成本，还达到了简便、快速、稳定的检测效果。
[0013] 3)以本发明所制备的单克隆抗体为核心建立的免疫学检测试剂盒，因其操作简 便、适用性强等特点，可有效地作用于田间作物中小麦黄花叶病毒的大规模检测，且可在基 层推广应用，为该病毒病的预测预警和科学防控提供了物质和技术支撑。
【附图说明】
[0014] 图1是dot-ELISA方法检测小麦黄花叶病毒的灵敏度分析；
[0015] 图2是dot-ELISA方法检测田间小麦样品中小麦黄花叶病毒的结果。
【具体实施方式】
[0016] 分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F4,能分泌抗小麦黄花叶病 毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6F4于2014年12月25日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMC No. 10296 ;
[0017] 抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10 7,抗体类型及亚类为 IgG2b、kappa链，该单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该 单抗体检测病叶的灵敏度达到1 : 20480倍稀释。
[0018] 抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体仅与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国 小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水 稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜 花叶病毒、小西萌芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒反应。
[0019] 抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建 立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本发明提供的杂交细胞瘤细胞株能大量分 泌抗小麦黄花叶病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测 WYMV的高通量血清学方法和检测试剂盒，并可应用于田间WYMV的检测，从而为我国小麦黄 花叶病毒早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。
[0020] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
[0021] -、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
[0022] 1.免疫原及检测抗原的制备
[0023] 用下面的操作步骤提供纯病毒粒子：
[0024] 1)将组织搅拌器预冷；
[0025] 2)取小麦病叶400g，剪碎加3X抽提缓冲液（0. 5M磷酸盐缓冲液，含0. 1%巯基乙 醇，0.0 lM Na-EDTA)，搅拌器搅碎，两层纱布过滤；
[0026] 3)滤液加1/4四氯化碳，冰浴搅拌5min，静置IOmin ;
[0027] 4) 8000rpm 离心 15min，取上清；
[0028] 5)上清，加入6% PEG(6000)，3% NaCl 和 1% Triton. X-100,冰浴搅拌至全部溶 解，4°C下放置6h或过夜；
[0029] 6)所有溶液8000rpm离心20min，取沉淀；
[0030] 7)沉淀用1/2 (v/v)悬浮缓冲液（0. 2M磷酸盐缓冲液，含0. 5M尿素、0. 1 %巯基乙 醇、0· OlM Na-EDTA)悬浮，1000 Orpm 离心 15min，取上清；
[0031] 8)上清加 5mL，30 % 鹿糖垫（含 0.3% Triton. X-100)，用 Beckman Optima L-100XP Type 70Ti 型转头 25000rpm，离心 2h ;
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