参与甜瓜葫芦素b合成的基因簇及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及参与甜瓜萌芦素 B合成 的基因簇及其应用。
【背景技术】
[0002] 甜瓜的苦味是由一类称为萌芦素 B的三萜化合物导致的。甜瓜果实中积累萌芦素 B会严重影响甜瓜的口感及品质。前期研究利用基因组学、分子生物学、生物化学等手段揭 示了由9个基因参与的黄瓜苦味物质萌芦素 C的合成途径，其中包括1个氧化角鲨烯环化 酶Bi，7个细胞色素 P450基因和1个乙酰基转移酶基因，并利用生物化学方法完全阐明了 四步反应，其对于萌芦科植物中其他类型的萌芦素生物合成路径的研究具有重要的指导意 义，也为植物中其他三萜化合物的通路解析提供了新思路。萌芦素具有抗虫作用，并且医学 研究证明萌芦素能够抑制多种癌细胞生长，目前萌芦素主要从植物中提取获得，不能通过 异源生物合成。而甜瓜中参与萌芦素 B生物合成的基因还没有被克隆，萌芦素 B生物合成 路径的解析将为开发新型抗癌药物提供基础。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供参与甜瓜萌芦素 B合成的基因簇及其应用。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明提供参与甜瓜萌芦素 B合成的蛋白，包括 Melo3C022377、Melo3C022376、Melo3C022375、Melo3C022374、Melo3C022373、Melo3C022372 和Melo3C002192,它们的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 1-7所示。
[0005] 本发明还提供参与甜瓜萌芦素 B合成的基因簇，所述基因簇由以下7个基因组成， Melo3C022377、Melo3C022376、Melo3C022375、Melo3C022374、Melo3C022373、Melo3C022372 和Melo3C002192,它们的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 9-15所示。
[0006] 本发明还提供含有所述参与甜瓜萌芦素 B合成的基因簇的载体、工程菌及宿主细 胞。
[0007] 本发明还提供所述参与甜瓜萌芦素 B合成的基因簇在调控甜瓜苦味合成中的应 用。
[0008] 本发明还提供所述参与甜瓜萌芦素 B合成的基因簇在调控萌芦素体外合成中的 应用。
[0009] 本发明还提供所述参与甜瓜萌芦素 B合成的基因簇在无苦味甜瓜分子育种中的 应用。
[0010] 前期研究中利用基因组学、分子生物学、生物化学等手段揭示了由9个基因参与 的黄瓜苦味物质萌芦素 C的合成途径，以此为基础，通过将甜瓜中的环化酶基因与黄瓜中 的氧化角鲨烯环化酶基因 Bi进行进化树分析，找到了一个与黄瓜Bi基因同源性最高的基 因 Mel〇3C022374 (Bi)，利用酵母表达体系证明了该基因编码萌芦二烯醇合成酶，是萌芦素 合成的关键酶。萌芦二烯醇还需要进一步被氧化和乙酰化才能生成萌芦素。为了解析萌 芦素 B合成的其他步骤，利用比较基因组学方法在甜瓜基因组中找到了一个类似于黄瓜萌 芦素 C 合成的基因簇：由 5 个 P450 基因（Melo3C022377、Melo3C022376、Melo3C022375、 Melo3C022372 和 Melo3C002192)、l 个乙酰转移酶基因（Melo3C022373)和 1 个Bi 基因 (Mel〇3C022374)组成。这7个基因在甜瓜各个组织中的表达状态非常相似，在幼苗时的根 中大量表达。此外，除了基因 Melo3C002192以外，其他基因与Bi基因均位于11号染色体 30kb的范围内，形成一个类似基因簇的结构。目前，以基因簇的形式参与重要次生代谢产物 合成在高等植物中被广泛发现，因此推测这7个候选基因很可能参与了萌芦素 B的合成。
[0011] 进一步利用酵母表达体系，在酵母中表达这些候选基因，用UPLC-Q-TOF仪分析 产物的精确分子量，推测可能发生的氧化反应产物，解析萌芦素 B合成中间步骤。首先， 在表达Bi、还原酶CPR和Melo3C002192的酵母中发现了两个特异产物，一个分子量为 441. 3727[M+H]，另一个为 457. 3676[M+H]，经过 MS、MS/MS 结果分析，推测 Melo3C002192 为多功能P450,在萌芦二烯醇合成中先羰基化，再羟基化。进一步将该产物从酵母中纯化 分离出来，利用核磁共振（NMR)解析其结构，发现基因 Mel〇3C002192催化萌芦二烯醇的 11号碳原子先发生羰基化（C3qH 48O2)，然后在20号碳原子上发生羟基化（C3qH48O 3)，进而证 明Mel〇3C002192为多功能基因，可连续氧化萌芦二烯醇，催化萌芦素 B合成的第二步和第 三步。继续利用酵母表达体系，表达更多的候选基因，利用类似的方法，仅在表达Bi、CPR、 Melo3C002192和Melo3C022375的酵母提取物中发现分子量为473. 3625[M+H]的特异产物， 推测上一步催化产物被Melo3C022375羟基化，进一步将该产物从酵母中分离纯化出来，利 用核磁共振（NMR)解析其结构，发现在2号碳原子上发生了羟基化（C 3idH48O4),进而证明了 Mel〇3C022375催化萌芦素 B合成的第四步。
[0012] 本发明首次在甜瓜基因组中发现参与萌芦素 B合成的基因簇，共由7个基因组成， 其中6个基因均位于11号染色体30kb的范围内。利用酵母体系成功解析了萌芦素 B合成 的第1至第4步反应。本发明进一步揭示了甜瓜苦味形成的分子机制，为无苦味甜瓜育种 提供了理论依据和分子辅助育种目标，可用于大规模筛选育种材料，大大加快高品质甜瓜 的育种进程；同时还为萌芦素的体外人工合成提供了宝贵经验，本发明可替代传统的从植 物材料中提取苦味素（萌芦素）的方法，利用合成生物学从而实现体外合成苦味素。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明通过比较基因组学以及RNA-Seq数据分析，从甜瓜基因组中发现与 苦味素（萌芦素 B)合成相关的基因簇。
[0014] 图2为本发明利用UPLC-Q-TOF检测参与苦味素合成第二步和第三步反应的结果； 其中，A为UPLC-Q-TOF检测到的Melo3C002192的特异产物，B为该特异产物的MS/MS检测 结果，C为核磁共振NMR结构解析结果。
[0015] 图3为本发明利用UPLC-Q-TOF检测参与苦味素合成第四步反应的结果；其中，A 为UPLC-Q-TOF检测到的Melo3C022375的特异产物，B为该特异产物的MS/MS检测结果，C 为核磁共振NMR结构解析结果。
【具体实施方式】
[0016] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0017] 实施例1参与甜瓜萌芦素 B合成的基因簇的挖掘与获得
[0018] 1、基因簇的挖掘
[0019] 以黄瓜苦味物质萌芦素 C合成基因簇研究为基础，利用比较基因组学方法，在甜 瓜基因组中找到了一个类似于黄瓜萌芦素 C合成的基因簇，共找到7个基因，包括1个萌 芦二烯醇合成酶基因 Bi(Melo3C022374)、5 个 P450 基因（Melo3C022377、Melo3C022376、 Melo3C022375、Melo3C022372 和 Melo3C002192)和 1 个乙酰转移酶基因（Melo3C022373)， 除了 Melo3C002192基因，其他基因均位于11号染色体30kb的范围内，形成一个类似基因 簇的结构，并