不对称干扰rna的组合物及其用图
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2008年8月27日，PCT申请进入国家阶段日为2010年4月26 日，申请号为：200880113236. 9,发明名称为"不对称干扰RNA的组合物及其用途"的专利申 请之分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及不对称干扰RNA的组合物及其用途。
【背景技术】
[0003] 通过使用小或短干扰RNA(siRNA)经由RNAi (RNA干扰）实现基因沉默，已显现为 是有力的分子生物学工具，并且具有用于治疗应用的潜力（de Fougerolles等人，2007; Kim 和 Rossi，2007)。
[0004] 理论上RNAi可以用于特异地有效地敲低（knockdown)或沉默任何疾病基因。对 于治疗目的而言RNAi的可能应用范围是广泛的，包括遗传性、外遗传性和传染性疾病，条 件是致病基因得到鉴定。
[0005] 然而，除突出的递送问题外，基于RNAi药物的开发还面临着如下问题：siRNA的有 限功效、siRNA的非特异性作用例如干扰素样应答和有义链介导的脱靶基因沉默、以及与 siRNA合成相关的高得惊人的或高昂的成本。siRNA的基因沉默功效，对于哺乳动物细胞中 的大多数基因，局限在50%或更低。这些分子的制造是昂贵的（比制造反义脱氧核苷酸昂 贵得多）、低效的，并且需要化学修饰。最后，观察到合成siRNAs的细胞外施用可能触发干 扰素样应答，这为基于RNAi的研究和基于RNAi的治疗开发增加了显著的障碍。
[0006] RNAi可以通过合成的短干扰RNA(SiRNAs)、或编码随后可以被核糖核酸酶III样 酶Dicer切割成siRNA的短发夹RNAs (shRNAs)的遗传元件触发。基因沉默的生化机制仍 未完全了解，看起来涉及多蛋白的RNA诱导沉默复合物（RISC)。RISC结合、展开且并入反 义siRNA链，随后其识别并靶向完全互补的mRNA进行切割，从而减少基因表达。有效的基 因沉默（1-10天）可归因于RISC复合物的催化性质。RNAi的力量源于能够达到的精致特 异性。然而，已知会发生脱靶RNAi效应。另一主要副作用是由siRNA激活的干扰素样应 答，其由dsRNA依赖性蛋白质激酶（PKR)和Toll样受体（TLR)介导。siRNA诱导干扰素样 应答的能力主要由其长度决定。（同上）。
[0007] 对于哺乳动物细胞中的基因沉默，现有技术教导siRNA的结构可以是19-21个核 苷酸长度和在2个末端上具有3'突出端的对称双链RNA，以在哺乳动物细胞中有效，并且 避免细胞先天"抗病毒"应答。（同上）。目前本领域已经充分确立，这种"最佳"结构仍会 触发干扰素应答，对基于RNAi的研究和基于RNAi的治疗开发构成显著障碍（Sledz等人， 2003)〇
[0008] 需要通过新设计siRNAs开发在哺乳动物细胞中实现有效RNAi的新方法，所述 siRNAs具有更佳功效和效力、作用启动快速、更佳持久和具有更短长度的RNA双链体，以避 免非特异性干扰素样应答和减少用于RNAi治疗剂的研究和药物开发的合成成本。
[0009] 本文引用的参考文献不应视为承认是请求保护的本发明的现有技术。
【发明内容】
[0010] 本发明涉及新类型的小双链体RNA的令人惊讶的发现，此新类型的小双链体RNA 可以在哺乳动物细胞中诱导有效的基因沉默，其在本文中称为不对称干扰RNA (aiRNA)。这 种新类型的RNAi诱导物的标志是2条RNA链的长度不对称。此种新的结构设计不仅在实 现基因沉默方面是功能上有效的，而且提供了优于现有技术siRNAs的几个优点。在这些优 点中，aiRNA可以具有比现有siRNA长度短得多的RNA双链体结构，这将减少合成成本且消 除/减少长度依赖性的非特异性干扰素样应答的触发。此外，aiRNA结构的不对称还消除/ 减少有义链介导的脱靶效应。此外，aiRNA在诱导基因沉默方面比siRNA更有效、有力、快 速开始和持久。aiRNA可以用于目前siRNA或shRNA正在应用或考虑应用的所有领域，包括 生物学研究、生物技术和医药工业中的R&D研究、和基于RNAi的治疗。
[0011] 本发明提供双链体RNA分子。该双链体RNA分子包括具有18-23个核苷酸长度的 第一链和具有12-17个核苷酸长度的第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且与第 一链形成双链区，其中第一链具有1-9个核苷酸的3' -突出端、和0-8个核苷酸的5' -突出 端，其中所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现选择性基因沉默。在一个实施方案中， 第一链包含与靶mRNA序列基本上互补的序列。在再一实施方案中，第一链包含与靶mRNA 序列至少70 %互补的序列。在另一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。
[0012] 在一个实施方案中，5'突出端的序列的至少一个核苷酸选自A、U和dT。
[0013] 在一个实施方案中，双链区的GC含量是20% -70%。
[0014] 在一个实施方案中，第一链具有19-22个核苷酸的长度。
[0015] 在一个实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度。在再一实施方案中，第二链 具有14-16个核苷酸的长度。
[0016] 在一个实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度，并且第二链具有15个核苷酸 的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有2-4个核苷酸的3'-突出端。在一个更 进一步的实施方案中，第一链具有3个核苷酸的3' -突出端。
[0017] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。 在一个进一步的实施方案中，该至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链和/或碱 基经修饰的核糖核苷酸。在一个更进一步的实施方案中，主链经修饰的核糖核苷酸在与另 一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。在一个实施方案中，磷酸二酯键经修饰而 包括氮或硫杂原子中的至少一种。在另一个实施方案中，核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯 基团的主链经修饰的核糖核苷酸。
[0018] 在一个实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是稀有碱基或经修饰的 碱基。在另一个实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸或其类似物包括肌苷或三苯甲基化 喊基。
[0019] 在再一实施方案中，核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸，其中2' -OH基团由 选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2S CN的基团替代，其中每个R独立地是C1-C6烷 基、链烯基或炔基，并且卤素是F、C1、Br或I。
[0020] 在一个实施方案中，第一链包括至少一个脱氧核苷酸。在一个进一步的实施方案 中，该至少一个脱氧核苷酸在选自3'-突出端、5'-突出端和双链区的一个或多个区域中。 在另一个实施方案中，第二链包括至少一个脱氧核苷酸。
[0021] 本发明还提供了调节细胞或生物中的基因表达的方法，其包括步骤：在可以发生 选择性基因沉默的条件下，使所述细胞或生物与权利要求1的双链体RNA分子接触，和通过 该双链体RNA分子介导针对与该双链RNA具有基本上对应的序列部分的靶基因或核酸的 选择性基因沉默。在一个进一步的实施方案中，所述接触步骤包括步骤：将所述双链体RNA 分子引入培养中的或生物体中的靶细胞内，在所述靶细胞中可以发生选择性基因沉默。在 一个更进一步的实施方案中，引入步骤选自转染、脂转染、电穿孔、感染、注射、经口施用、吸 入、局部和区域施用。在另一个实施方案中，引入步骤包括使用药学上可接受的赋形剂、载 体或稀释剂，其选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、纳米乳 液（nanoemulsion)、脂质和类脂（lipoid)。
[0022] 在一个实施方案中，该调节方法用于确定基因在细胞或生物中的功能或用途。
[0023] 在一个实施方案中，该调节方法用于治疗或预防疾病或非期望的状况。
[0024] 在一个实施方案中，靶基因与哺乳动物中的疾病、病理状况或非期望的状况相关。 在一个进一步的实施方案中，靶基因是致病微生物的基因。在一个更进一步的实施方案中， 靶基因是病毒基因。在另一个实施方案中，靶基因是肿瘤相关基因。在另外一个实施方案 中，靶基因是与选自下述的疾病相关的基因：自身免疫疾病、炎性疾病、退行性疾病、感染性 疾病、增生性疾病、代谢疾病、免疫介导的病症、变应性疾病、皮肤病学疾病、恶性疾病、胃肠 道病症、呼吸病症、心血管病症、肾病症、类风湿性病症、神经学病症、内分泌紊乱和衰老。
[0025] 本发明提供了研究试剂。该试剂包括双链体RNA分子。
[0026] 本发明进一步提供了试剂盒。该试剂盒包括具有18-23个核苷酸长度的第一 RNA 链和具有12-17个核苷酸长度的第二RNA链，其中第二链与第一链基本上互补，并且能够 与第一链形成双链体RNA分子，其中双链体RNA分子具有1-9个核苷酸的3' -突出端、和 0-8个核苷酸的5' -突出端，其中所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现序列特异性基 因沉默。
[0027] 本发明还提供了制备双链体RNA分子的方法。该方法包括步骤：合成第一链和第 二链，在形成能够实现序列特异性基因沉默的双链体RNA分子的条件下，组合所合成的链。 在一个实施方案中，权利要求35的方法还包括在合成步骤过程中、在合成后且在组合步骤 前、或在组合步骤后，将至少一个经修饰的核苷酸或其类似物引入双链体RNA分子内的步 骤。在另一个实施方案中，所述RNA链是化学合成的或生物合成的。
[0028] 本发明提供表达载体。该载体包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码 双链体RNA分子的一个或多个核酸。在一个实施方案中，该载体包括与第一表达控制序列 可操作地连接的编码第一链的第一核酸、和与第二表达控制序列可操作地连接的编码第二 链的第二核酸。在另一个实施方案中，该载体是病毒、真核或细菌表达载体。
[0029] 本发明还提供细胞。在一个实施方案中，该细胞包括载体。在另一个实施方案中， 该细胞包括双链体RNA分子。在一个进一步的实施方案中，该细胞是哺乳动物、禽类或细菌 细胞。
[0030] 本发明提供双链体RNA分子。该双链体RNA分子包括第一链和第二链，其中第一 链长于第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且与第一链形成双链区，其中所述双链 体RNA分子能够在真核细胞中实现选择性基因沉默。在一个实施方案中，双链体RNA分子 的2个末端独立地选自1-10个核苷酸的3' -突出端、0-10个核苷酸的5' -突出端和平头末 端。在一个实施方案中，第一链与靶mRNA序列基本上互补。在一个备选实施方案中，第二 链与靶mRNA序列基本上互补。在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。 在另一个实施方案中，双链体RNA分子是分离的双链体RNA分子。
[0031] 在一个实施方案中，第一链具有1-8个核苷酸的3'-突出端、和1-8个核苷酸的 5'-突出端。
[0032] 在另一个实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的3' -突出端和平头末端。
[0033] 在另外一个实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的5' -突出端和平头末端。
[0034] 在一个备选实施方案中，RNA双链体具有两个1-8个核苷酸的5' -突出端、或两个 1-10个核苷酸的3'-突出端。
[0035] 在一个实施方案中，第一链具有12-100个核苷酸、12-30个核苷酸、18-23个核苷 酸、19-25个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度。
[0036] 在另一个实施方案中，第二链具有5-30个核苷酸、12-22个核苷酸、12-17个核苷 酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第二链具有15个核苷酸的长度。
[0037] 在一个实施方案中，第一链具有12-30个核苷酸的长度，并且第二链具有10-29个 核苷酸的长度，条件是当双链区是27bp时，RNA分子的2个末端独立地是3'突出端或5' 突出端。在一个进一步的实施方案中，第一链具有18-23个核苷酸的长度，并且第二链具有 12-17个核苷酸的长度。
[0038] 在另一个实施方案中，第一链具有19-25个核苷酸的长度，并且第二链具有12-17 个核苷酸的长度。
[0039] 在一个备选实施方案中，第一链具有19-25个核苷酸的长度，并且第二链具有 18-24个核苷酸的长度，
[0040] 条件是当第一链是
[0041] 5' -UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU(SEQ ID N0:1)
[0042] 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG(SEQ ID N0:2)或
[0043] 5' -CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA(SEQ ID N0:3)时
[0044] 第二链具有至多17个核苷酸的长度，或包含至少一个与第一链的错配，或包含至 少一个修饰。
[0045] 在一个实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度，并且第二链具有12-17个核 苷酸、或14-16个核苷酸的长度。
[0046] 在一个实施方案中，第一链比第二链长1-10个核苷酸。
[0047] 在一个实施方案中，3' -突出端具有2-6个核苷酸的长度。
[0048] 在另一个实施方案中，5' -突出端具有0-5个核苷酸的长度。
[0049] 在一个实施方案中，基因沉默包括RNA干扰、翻译调节和DNA外遗传调节中的一种 或两种或全部。
[0050] 在一个实施方案中，双链体RNA分子还在所述第一链和第二链的至少一个中包括 切口。
[0051] 在另一个实施方案中，双链区包括一个或多个核苷酸的缺口。
[0052] 在一个实施方案中，5'突出端的至少一个核苷酸与革ElmRNA序列不互补。
[0053] 在另一个实施方案中，5'突出端的至少一个核苷酸选自A、U和dT。
[0054] 在一个实施方案中，双链体RNA分子与选自肽、抗体、聚合物、脂质、寡核苷酸、胆 固醇和适体（aptamer)的实体缀合。
[0055] 在一个实施方案中，该RNA分子还包括至少一个未配对的或错配的核苷酸。
[0056] 在另一个实施方案中，双链区的GC含量是20-70%。
[0057] 在一个实施方案中，3' -突出端和/或5' -突出端被稳定化以抵抗降解。
[0058] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。 在一个进一步的实施方案中，该至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、主链和/或碱 基经修饰的核糖核苷酸。在一个进一步的实施方案中，主链经修饰的核糖核苷酸在与另一 个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。在另一个实施方案中，磷酸二酯键经修饰而 包括氮或硫杂原子中的至少一种。在另外一个实施方案中，核苷酸类似物是包含硫代磷酸 酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸。
[0059] 在一个实施方案中，该至少一个经修饰的核苷酸或其类似物包括非天然碱基或经 修饰的碱基。在另一个实施方案中，该至少一个经修饰的核苷酸或其类似物包括肌苷或三 苯甲基化碱基。
[0060] 在再一实施方案中，核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸，其中2' -OH基团由 选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团替代，其中每个R独立地是C1-C6烷 基、链烯基或炔基，并且卤素是F、C1、Br或I。
[0061] 在一个实施方案中，第一链包括至少一个脱氧核苷酸。在一个进一步的实施方案 中，该至少一个脱氧核苷酸在选自3'-突出端、5'-突出端和靠近第一链的5'末端的双链区 的一个或多个区域中。在另一个实施方案中，第二链包括至少一个脱氧核苷酸。
[0062] 本发明还提供调节细胞或生物中的基因表达的方法。该方法包括步骤：在可以发 生选择性基因沉默的条件下，使所述细胞或生物与权利要求1的双链体RNA分子接触，和由 该双链RNA分子介导实现针对与该双链RNA具有基本上对应的序列部分的靶核酸的选择性 基因沉默。在一个进一步的实施方案中，所述接触包括步骤：将所述双链体RNA分子引入 培养中的或生物体中的靶细胞内，在所述靶细胞中选择性基因沉默可以发生。在一个更进 一步的实施方案中，引入步骤选自转染、脂转染、电穿孔、感染、注射、经口施用、吸入、局部 和区域施用。在另一个实施方案中，引入步骤包括使用药学上可接受的赋形剂、载体或稀释 剂，其选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳米颗粒、纳米乳液、脂质 和类脂。在一个实施方案中，该调节方法用于调苄基因在细胞或生物中的表达。
[0063] 在另一个实施方案中，该调节方法用于治疗或预防疾病或非期望状况。
[0064] 在一个实施方案中，靶基因是与人或动物疾病相关的基因。在一个进一步的实施 方案中，靶基因是致病微生物的基因。在一个更进一步的实施方案中，靶基因是病毒基因。 在另一个实施方案中，靶基因是肿瘤相关基因。
[0065] 在另外一个实施方案中，靶基因是与选自下述的疾病相关的基因：自身免疫疾病、 炎性疾病、退行性疾病、感染性疾病、增生性疾病、代谢疾病、免疫介导的病症、变应性疾病、 皮肤病学疾病、恶性疾病、胃肠道病症、呼吸病症、心血管病症、肾病症、类风湿性病症、神经 学病症、内分泌紊乱和衰老。
[0066] 该调节方法还可以用于在体外或体内研究药物靶标。
[0067] 本发明提供包括双链体RNA分子的试剂。
[0068] 本发明还提供试剂盒。该试剂盒包括第一 RNA链和第二RNA链，其中第一链长于 第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且能够与第一链形成双链体RNA分子，其中 所述双链体RNA分子能够在真核细胞中实现序列特异性基因沉默。
[0069] 本发明还提供制备权利要求1的双链体RNA分子的方法，其包括步骤：合成第一链 和第二链，和在形成能够实现序列特异性基因沉默的双链体RNA分子的条件下，组合所合 成的链。在一个实施方案中，RNA链是化学合成的或生物合成的。在另一个实施方案中，第 一链和第二链是分开或同时合成的。
[0070] 在一个实施方案中，该方法进一步包括在合成步骤过程中、在合成后且在组合步 骤前、或在组合步骤后，将至少一个经修饰的核苷酸或其类似物引入双链体RNA分子内的 步骤。
[0071] 本发明进一步提供了药物组合物。该药物组合物包括至少一种双链体RNA分子作 为活性剂和一种或多种载体，所述载体选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚 合物、纳米颗粒、胆固醇、脂质和类脂。
[0072] 本发明还提供治疗方法。该方法包括给有需要的受试者施用有效量的药物组合 物。在一个实施方案中，药物组合物经由选自iv、sc、吸入、局部、PO和区域施用的途径进行 施用。
[0073] 在一个实施方案中，第一链包括与基因的靶mRNA序列基本上互补的序列，所述基 因选自：发育基因，癌基因，肿瘤抑制基因和酶基因，以及粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑 制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、Winged螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋 巴因子或其受体、生长/分化因子或其受体、神经递质或其受体、激酶、信号转导蛋白的基 因，病毒基因，感染性疾病的基因、ABLI、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、 EBRB2, ETSl、ETSl、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、 MYC, MYCL1、MYCN、NRAS、P頂1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3 和 YES、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、 MCC, NF1、NF2, RB1、TP53、WT1、ACP去饱和酶或羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱 氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、DNA或RNA 聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、转化 酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂 酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶或肽酶、普鲁兰酶、重组酶、逆转录酶、拓扑异构 酶、木聚糖酶、k-RAS、β -联蛋白（β-catenin)、1^1^1、？〇熟、卩70361(、存活蛋白（3111^;^;[11)、 mTOR、PTEN、Parpl 或 p21 的基因。
[0074] 在另一个实施方案中，双链体RNA分子选自
[0075]
[
[0078] 其中A、U、G和C是核苷酸，而a、t、g和c是脱氧核苷酸。
[0079] 本发明提供修饰第一双链体RNA分子的方法，所述双链体RNA分子具有形成双链 区的反义链和有义链。该方法包括：缩短有义链的长度，从而使得反义链具有1-8个核苷酸 的3' -突出端和0-8个核苷酸的5' -突出端，和形成第二双链体RNA分子；其中第一双链体 RNA分子的至少一种性质得到改善。在一个实施方案中，所述性质选自大小、功效、效力、开 始的速度、持久性、合成成本、脱靶效应、干扰素应答和递送。在另一个实施方案中，该方法 进一步包括在形成第二双链体RNA分子的条件下组合反义链和缩短的有义链。在一个进一 步的实施方案中，第一双链体RNA分子是siRNA、或dicer-底物siRNA、或siRNA前体。
[0080] 本发明提供表达载体。该载体包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码 权利要求1的双链体RNA分子的一个或多个核酸。在一个实施方案中，该表达载体包括与 第一表达控制序列可操作地连接的编码第一链的第一核酸、和与第二表达控制序列可操作 地连接的编码第二链的第二核酸。在另一个实施方案中，该表达载体是病毒、真核表达载体 或细菌表达载体。
[0081] 本发明还提供细胞。在一个实施方案中，该细胞包括表达载体。在另一个实施方 案中，该细胞包括双链体RNA分子。在另外一个实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞、禽类 细胞或细菌细胞。
[0082] 从本文提供的其它描述，包括不同实施例，本发明的其他特征和优点将是显而易 见的。所提供的实施例举例说明在实践本发明中有用的不同组分和方法。实施例不限制请 求保护的本发明。基于本公开内容，本领域技术人员可以鉴定和采用对于实践本发明有用 的其他组分和方法。
【附图说明】
[0083] 图IA显示在第一链上具有3' -突出端和5' -突出端的双链体RNA分子结构。
[0084] 图IB显示在第一链上具有3' -突出端和5' -突出端以及在双链体中具有切口的 双链体RNA分子的结构。
[0085] 图IC显示在第一链上具有3'-突出端和5'-突出端以及在第二链中具有缺口的 双链体RNA分子的结构。
[0086] 图2A显示具有一个平头末端和在第一链上的5' -突出端的双链体RNA分子的结 构。
[0087] 图2B显示具有一个平头末端和在第一链上的3' -突出端的双链体RNA分子的结 构。
[0088] 图2C显示在双链体的2个末端上均具有3' -突出端并且第一链长于第二链的双 链体RNA分子的结构。
[0089] 图2D显示在双链体的2个末端上均具有5' -突出端并且第一链长于第二链的双 链体RNA分子的结构。
[0090] 图3显示通过aiRNA(不对称干扰RNAs)诱导的β -联蛋白的基因沉默。
[0091] 图3Α显示寡聚物的验证。在退火后，寡聚物通过20%聚丙烯酰胺凝胶加以证实。 泳道 1，21nt/21nt ;泳道 2,12nt (a) /21nt ;泳道 3,12nt (b) /21nt ;泳道 4,13nt/13nt ;泳 道 5,13nt/21nt ;泳道 6,14nt/14nt ;泳道 7,14nt (a) /21nt ;泳道 8,14nt (b) /21nt ;泳道 9， 15nt/15nt ;泳道 10,15nt/21nt〇
[0092] 图3B显示寡聚物在基因沉默中的作用。HeLa细胞以200, 000细胞/孔接种到6 孔培养板内。24小时后，它们用scramble siRNA(泳道1)、靶向E2F1的21-bp siRNA(泳 道2,作为特异性的对照）或靶向β-联蛋白的21-bp SiRNA(泳道3,作为阳性对照）、 或相同浓度的不同长度混合的aiRNA :12nt(a)/21nt (泳道4) ;12nt(b)/21