一种利用天然纤维素为唯一碳源进行同步糖化发酵的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及利用基因工程手段构建能利用木质纤维素为唯一碳源进行发酵的工 程菌，可利用天然玉米芯粉为唯一碳源进行同步糖化发酵生产纤维素乙醇。属于工业生物
技术领域。
【背景技术】：
[0002] 目前以粮食作物为原料的生物乙醇技术发展较为成熟，但是在粮食日益紧缺的今 天，如何利用其它更加廉价资源更加丰富的原料来生产生物乙醇成为人们需要考虑的问题 之一。玉米芯以其含有丰富的纤维素和半纤维素成分，进入了人们的视线，作为一个农业大 国，我国玉米的年产量约在1.5亿吨，相应的玉米芯的产量也在4000万吨左右。但是每年 有很大一部分的玉米芯被焚烧和掩埋处理，这不仅导致了资源的浪费，还造成了严重的环 境污染。因此如何有效的利用玉米芯生产乙醇成为了近来研究的重点。
[0003] 在生产工艺当中，根据木质纤维素的糖化和发酵过程是否在同一反应器中进行， 可以将纤维素发酵生产乙醇的过程分为：分步水解发酵和同步糖化发酵。
[0004] 分步水解发酵是指纤维素的糖化过程和发酵生产乙醇的过程是在不同的反应器 之中分步进行。最初的纤维素生产乙醇大多使用此方法。此方法是在反应器中用纤维素酶 将纤维素进行水解得到纤维素水解糖，之后再在另一反应器中利用酵母或其他菌株将水解 糖进行发酵生产乙醇。对于酶法水解而言，其缺点在于纤维素被水解产生的葡萄糖会抑制 水解过程，造成纤维素酶需求量的加大。其次，在发酵的过程中，存在低细胞浓度以及高浓 度基质的抑制的问题，导致乙醇产量较低。这些问题都导致生产成本的增加，不利于木质纤 维素的工业化利用。
[0005] 为了解决这些问题，同步糖化发酵应运而生。在纤维素酶对纤维素糖化的同时，生 成的葡萄糖立即被酵母利用进入发酵过程，可以消除糖化产物对纤维素酶的抑制作用，由 此达到提高终产物产率，减少成本，缩短生产周期等目的。此过程的关键是需既能产生纤维 素酶又能进行乙醇发酵菌株的构建。
【发明内容】
：
[0006] 为了实现利用玉米芯纤维素为唯一碳源进行同步糖化发酵，本发明提供了一种通 过构建能直接利用纤维素的基因工程菌，从而达到利用玉米芯纤维素进行同步糖化发酵生 产乙醇的方法。
[0007] 本发明所采用的具体步骤：
[0008] 1、载体 pHBM368-pgk 的构建。
[0009] 以表达载体PHBM368 (如图1)为基础，构建带有组成型强启动子pgkl的表达载体 pHBM368-pgk(如图2)。利用PCR技术分别扩增5' -端和3' -端引入Nde I酶切位点和 Not I酶切位点的pgkl启动子序列（基因序列见序列表1)。通过T4 DNA Ligase将pgkl 启动子序列与经限制性内切酶Nde I和Not I消化的pHBM368连接得到pHBM368-pgk。
[0010] 2、分泌型表达载体 PHBM368-P-SB、PHBM368-P-SC、PHBM368-P-SE 的构建。
[0011] 按基因文库号分别合成β -葡萄糖苷酶基因（bg，GeneBank :AF163097)、纤维素 外切葡聚糖酶基因（cbh，GeneBank :AY861348)、纤维素内切葡聚糖酶基因（eg，GeneBank: EU169241)序列（bg、cbh、eg基因序列见序列表2-4)。在bg、cbh、eg的5'端和3'端分 别引入Sna B I酶切位点和Xba I酶切位点。以pPIC9K载体为模板PCR扩增出5' -端和 3'_端分别带有Not I和SnaB I的信号肽序列（SS)。用T4 DNA Ligase将SS分别与bg、 cbh、eg 相连形成 SS-bg、SS-cbh、SS-eg。再通过 T4 DNA Ligas 将带有 Not I 及 Xba I 粘 性末端的SS-bg、SS-cbh、SS-eg分别连接到经Not I和Xba I酶切的pHBM368-pgk载体，得 到重组质粒 PHBM368-P-SB、pHBM368-P-SC、pHBM368-P-SE (如图 3)。
[0012] 3、酿酒酵母的转化。
[0013] 用 Hpa I 将 pHBM368-P-SB、pHBM368-P-SC、pHBM368-P-SE 线性化，在 1800V 电压 下电转化到酿酒酵母INVScl中。以2%羧甲基纤维素为碳源代替Yro培养基中葡萄糖成 分的固体培养基进行功能筛选，筛选出能利用纤维素的酿酒酵母INVSC-P-SB、INVSC-P-SC、 INVSc-P-SE重组菌株。
[0014] 在IL的反应器中，用玉米芯纤维素为唯一碳源，将三种重组菌株进行单一菌株及 混合菌株的同步糖化发酵。
[0015] a)在YPD固体培养基平板上挑取重组酵母INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVSc-P-SE 的单菌落分别接入50mL ΥΗ)液体培养基，28°C，200rpm摇瓶培养。
[0016] b)在摇瓶培养菌液浓度达到0D6。。= 2. 0时，分别将INVSc-P-SC、INVSc-P-SE及 INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVSc-P-SE三者的培养液各5ml混合的培养液15ml作为种子液 接种至IL反应器的YPC液体培养基中，在28°C发酵。
[0017] c)经过约120小时发酵后，气相色谱检测发酵液中乙醇浓度，乙醇浓度可达到 2. 35-6. 37g/L〇
[0018] 所述的YH)固体培养基为1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂粉，YH)液体 培养基为1 %酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖。
[0019] 所述的YPC液体培养基为1 %酵母粉，2 %蛋白胨，2 %玉米芯。
[0020] 结果表明重组菌株INVSc-SC、INVSc-SE可以直接利用玉米芯粉作为唯一碳源进 行连续同步糖化发酵产生乙醇，避免了传统纤维素乙醇工艺中水解和糖化分不同反应器进 行的工艺局限。本发明中整合纤维素酶的酿酒酵母基因工程菌混合菌对玉米芯粉进行直接 发酵可得到更高的乙醇产率。经发酵条件优化可进一步提高乙醇产量。
[0021] 本发明通过纤维素酶基因的导入，构建出能直接利用天然木质纤维素为唯一碳源 的酿酒酵母基因工程菌，并利用此基因工程菌实现以玉米芯纤维素为唯一碳源的同步糖化 发酵。本方法适用于以其他天然木质纤维素（如玉米秸杆、水稻秸杆等）原料的纤维素乙 醇工艺。
【附图说明】：
[0022] 图1表达载体PHBM368的结构图。AC:凝集素基因 。CYCl TT :来自于细胞色素 C 的转录终止子。rDNA:来自于酿酒酵母的同源rDNA基因。Ampf:氨节抗性基因 。ColE ori : 大肠杆菌复制起始位点。URA3:尿嘧啶合成基因。PGAL1:诱导性启动子gall。Kan1^卡那 霉素抗性基因。
[0023] 图2表达载体pHBM368-pgk的结构图。AC:凝集素基因。pPGK:组成型启动子 Pgkl。CYCl TT:来自于细胞色素 C的转录终止子。rDNA:来自于酿酒酵母的同源rDNA基 因。Amp%氨苄抗性基因 。ColE ori:大肠杆菌复制起始位点。URA3:尿嘧啶合成基因。
[0024] 图 3 分泌型表达载体 pHBM368-P-SB、pHBM368-P-SC、pHBM