多功能多肽/脂质体/透明质酸组装的类病毒核酸载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种药物技术领域的药物输送技术，特别是一种可用于核酸 (DNA、siRNA、micr 〇RNA以及shRNA等）体内系统输送的非病毒载体体系的构建及制备技术， 具体涉及一种多功能多肽/脂质体/透明质酸组装的类病毒核酸载体。
【背景技术】
[0002] 在基因治疗中，核酸药物从概念走向临床应用的关键性瓶颈是其体内输送系统的 研发。其中非病毒载体以聚阳离子和阳离子脂质体为主，它们相比病毒载体而言除了载 体本身没有生物安全隐患之外，还具有成本低，基因担载密度和担载分子量大、制备简单， 便于化学修饰等优势，也存在着化学毒性大、体内循环周期短（不利于靶向）的缺点。在 科学家为了有效解决合成载体自身的缺点，发挥其优势，从而达到体内安全高效输送核酸 的过程中，上述两种载体近二十年来已经发展成为以下两类新型载体，其一是通过对聚阳 离子的不断改进的生物大分子输送体系[Venkataraman，S等，聚阳离子聚（甲基丙烯酸 二甲基氨基乙酯）的分子量与PEG化程度在基因输送中的影响，生物材料，2011，32,（9)， 2369-78. ]，[Zhang，W等，PEG化透明质酸包裹的聚阳离子/DNA复合物的基因输送效率和 生物相容性，生物材料，2013, 34,（27),6495-503.];其二是通过对阳离子脂质体进行多功 能修饰的脂质输送体系[Maitani，Y等人，从传统到隐形脂质体：癌症化疗的新前沿，肿瘤， 2003,89,（3),237-49.]，前者主要通过对聚阳离子接枝聚乙二醇（PEG)和靶向基团，来达 到体内长效循环并靶向特定细胞的目的，这种方法除了聚阳离子本身的毒性外，还存在高 分子化学接枝率难以控制，PEG的物理共混和接枝后的嵌段共聚物难以分离等问题[Lai， T等人，生物响应的pH值敏感多聚乙二醇嵌段共聚物作为DNA载体，药学研究，2010, 27， (11),2260-73.]。近年来顾忠伟等人利用透明质酸和聚乙烯亚胺（PEI)包裹输送核酸，希 望达到体内长效循环，靶向特定肿瘤细胞，并能够突破细胞内壁垒顺利到达治疗位点，但聚 阳离子并不能完全封闭包裹的核酸，容易被表面覆盖的透明质酸置换出来。另一方面，单 纯依靠对阳离子脂质体本身的不断修饰（如接枝PEG、靶向基团等方法）同样存在载体 组装不稳定，很难突破体内的生物学壁垒，安全有效地将核酸药物输送到特定的治疗位点 等问题[[Maitani，Y等人，从传统到隐形脂质体：癌症化疗的新前沿，肿瘤，2003,89,（3)， 237-49.]。所以经过不断发展，出现了利用聚阳离子、脂质体相结合的方法构建核酸输送 纳米颗粒（lipopolyplexes) [Posadas, I等人，利用非病毒载体输送siRNA到中枢神经系 统，纳米医学，2010, 5，（8),1219-36.]，即首先使聚阳离子与核酸形成复合物（polyplex), 然后通过静电作用将polyplex包裹在带有相反电荷的脂质体中。从而形成了较前二者更 高活性与降低了毒性的新生代非病毒载体。这方面的文献虽然不算少，但其主要特点是通 过变换不同的聚阳离子或利用其它的类似聚阳离子功能的生物材料来包裹核酸形成二元 复合物，再与阳离子脂质体进行进一步自组装构建lipopolyplexes.目前按不同的包裹核 酸的材料分为三类：首先是Huang. L教授等人利用鱼精蛋白或磷酸钙盐与阳离子脂质体包 裹核酸自组装成的三元复合物[Zhang，J等人，输送siRNA治疗乳腺癌的非病毒载体，控 释杂志，2014];其次是伦敦大学学院Hart，S L教授为代表的利用阳离子脂质体和含有 靶向序列的阳离子多肽与核酸组装成的多功能靶向受体的纳米颗粒（RTNs);以及其它利 用天然的或合成的阳离子聚合物、阳离子脂质体，以及核酸组装的三元复合物[Hart，S.L， 多功能纳米复合物的基因输送和基因治疗，细胞生物学和毒理学，2010, 26,（1),69-81]。 Lipopolyplexes的优点是利用各组成成分的协同效应，将各组成成分功能专一化，即利用 聚阳离子来包裹核酸，依靠脂质体的融膜作用来突破细胞膜与内涵体膜，从而提高了载体 对核酸的的包裹与细胞内输送能力。其缺点是除了包括聚阳离子的高毒性外，该类载体仍 然通过将外围的阳离子脂质体化学接枝聚乙二醇（PEG)和靶向基团来实现体内长效循环 与靶向特定组织细胞表面的受体，大量的实验结果显示这类载体体内效果不太理想。其中 Hart，S. L教授制备的多功能受体靶向纳米颗粒虽然利用多肽与脂质体实现了载体体内 生物相容性与大大减小的毒性，并且利用多肽进行包裹核酸的同时进行靶向细胞表面的受 体，但其在屏蔽电荷方面没有新的优势，仍然需要通过PEG化的脂质体来参与，因为PEG的 多少直接决定载体在体内能否长效循环，这就使问题变得复杂化。目前还没有能够突破该 三元复合体共有缺点的新型载体。本发明就是在Iipolyplexes的基础上构建了一类发挥 其优点并突破其弊端的药用载体。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有核酸体内输送技术中的不足，提供一种可以紧密 包裹核酸、表面带负电荷以便体内长效循环、靶向特定细胞并有效进入细胞内的多功能 多肽/脂质体/透明质酸组装的类病毒核酸载体；更具体来说，是一种多功能阳离子 多肽/脂质体/透明质酸协同组装的靶向特定细胞表面的高效安全的类病毒核酸载体 (Q-complexeses) 〇
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005] 第一方面，本发明涉及一种多功能多肽/脂质体/透明质酸组装的类病毒核酸载 体，所述类病毒核酸载体是表面带负电荷的具有双靶向基团的纳米级核酸载体；所述类病 毒核酸载体的内核是由多功能多肽与阳离子脂质体共混，加入核酸进行自组装形成的（表 面带正电荷的）纳米颗粒；所述类病毒核酸载体的外壳是聚阴离子，所述聚阴离子通过静 电作用包裹在所述纳米颗粒的表面。
[0006] 优选的，所述聚阴离子选自透明质酸、透明质酸钠、羧甲基壳聚糖中的一种或几 种。
[0007] 优选的，所述阳离子脂质体是由阳离子脂质与中性脂质或胆固醇形成的脂质体。
[0008] 优选的，所述阳离子脂质体具有阳离子双层磷脂膜。
[0009] 优选的，所述多功能多肽是由阳离子多肽序列与细胞穿透肽序列直接连接而成。
[0010] 优选的，所述多功能多肽包含SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
[0011] 优选的，所述核酸选自 DNA、siRNA、microRNA 或 shRNA。
[0012] 第二方面，本发明还涉及一种前述的多功能多肽/脂质体/透明质酸组装的类病 毒核酸载体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0013] A、通过薄膜分散法制备阳离子脂质体：阳离子脂质与中性脂质或胆固醇水合作用 制得阳离子脂质体；
[0014] B、纳米载体的制备：将所述阳离子脂质体稀释到到5~10 μ g/mL，与20~40 μ g/ mL的多功能多肽混合后，加入到核酸中，常温孵育，制得表面带正电荷的纳米颗粒；
[0015] C、将所述表面带正电荷的纳米颗粒与聚阴离子溶液混合均匀，即得所述多功能多 肽/脂质体/透明质酸组装的类病毒核酸载体。
[0016] 优选的，所述阳离子脂质体、多功能多肽、核酸的质量比为（0.5~2) : (2~ 6) : 1;所述聚阴离子、核酸的质量比为10 : 1~40 : 1。更优选，所述阳离子脂质体、多功 能多肽、核酸的质量比为（0.75~I) : 4 : 1;所述聚阴离子、核酸的质量比为14. 2 : 1~ 33.6 : 1〇
[0017] 第三方面，本发明还涉及一种前述的多功能多肽/脂质体/透明质酸组装的类病 毒核酸载体在作为体内系统输送核酸体系中的用途。
[0018] 本发明通过核酸、包含阳离子多肽-b_细胞穿透胎的两嵌段序列多肽（如图1)、阳 离子脂质体，以及透明质酸通过协同效应自组装构建的纳米载体的组成与功能如下：
[0019] (1)利