子宫内注射外源基因法生产转基因哺乳动物的技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备转基因哺乳动物的方法。
【背景技术】
[0002]哺乳动物转基因技术是由基因工程和胚胎工程相结合的一门新型生物技术。它是将人工重组的外源DNA通过人为的方法导入受体动物的基因组，或者切除受体基因组中的一段DNA，从而使受体动物的遗传信息(基因型和表现型)发生人为性的改变，并且这种改变能遗传给后代的一门生物技术[1]。
[0003]自1974年的嵌合体小鼠[2]诞生以来，哺乳动物转基因技术给发育生物学、医学和畜牧业等学科领域带来了一场新的技术革命。随着分子生物学和生物技术的发展，哺乳动物转基因技术取得了长足的发展。借助转基因动物模型R4'5]，将分子、细胞、组织、器官、及个体的发生发育和衰老统一起来，从时间和空间综合角度研究基因的表达调控规律；通过转基因动物模型，可研究遗传病的发生、发展规律，随着基因定点整合[6'7]技术的成熟，转基因技术可能成为治愈人类遗传疾病的一种重要手段；通过转基因技术培育抗病力强、生长速度快、畜产品产量和质量高的转基因动物，以及通过转基因动物生产药用或营养蛋白[8’9]、为人类提供异源器官等，最终提高畜牧业的经济效益。
[0004]自20世纪80年代的嵌合体鼠诞生以来，各国学者不断寻求以操作简单、成本低、高效转基因的为目的转基因技术。但是，到目前对哺乳动物进行转基因生产常用的转基因手段为:显微注射法、精原干细胞转染、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞法、原始生殖细胞(PGC)和精子等技术方法。
[0005]1.显微注射(microinject1n)法
显微注射(microinject1n),利用显微操作技术,直接将精子注射到成熟卵母细胞胞质的方法，称为胞浆内精子注射技术。在显微操作环境中，采用该技术方法，将体外构建好的目的基因片段注射到原核时期的受精卵的原核当中，随着受体受精卵DNA合成或修复，外源基因整合到其基因组中。显微注射法是目前公认的转基因效果最好，制作转基因动物应用最广的操作方法[1M1]。
[0006]显微注射法的优点是可以把10kb以下的不同长度且不含原核载体的DNA片段注入原核当中，并能得到外源基因有效表达的阳性转基因动物。但是，该技术也存在着许多制约因素，基因组DNA只能增加不能敲除或在指定的位点修饰，而且外源DNA的整合位点和拷贝数也无法控制；显微注射法成本之昂贵，胚胎成活率之低，尤其是大家畜上，制备一个转基因动物时需要大量的胚胎为基础，再加上设备昂贵、操作复杂，以及对技术人员操作技术要求高等因素限制该技术应用。
[0007]2逆转录病毒感染法
1976年，虽然Jaenich等是首次利用逆转录病毒感染法获得了阳性小鼠，但是外源基因却表现为沉默。直到1998年，Chan LI等[12]利用慢病毒成功转染牛的卵母细胞和Cabot (2001)等[13]成功转染体外成熟的猪卵母细胞，并获得转基因猪，逆转录病毒感染法才重新被人们广泛重视。
[0008]逆转录病毒是双链RNA病毒，侵染细胞后在自身的反转录酶的作用下，以RNA为模板在寄主细胞染色体中反转录成DNA。其具体方法是将载体病毒放入动物早期胚胎的培养液中[14]、将载体病毒注入囊胚腔[15’16]、体外培养转染精子或卵母细胞[17’18]。用逆转录病毒载体法生产转基因动物具有操作简单、不受胚胎发育阶段的影响，并且基因表达效率高；单位点、单拷贝整合，易鉴别分析插入位点等优点。但是，用此法感染胚胎细胞时，如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物；但是，如果发生在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，嵌合体的下一代可能有纯系转基因动物，这样的话实验周期就很长。并且所携带的外援基因片段长度受到很大的限制，一般不能超过10kb[19]。
[0009]随着对逆转录病毒感染法的深入研究，人们发现基因沉默现象，其主要作用机制为:反式作用因子可通过与病毒启动子内特异序列结合而影响DNA前病毒的表达；整合的前病毒及两侧宿主DNA序列的甲基化，抑制其表达[2°]。
[0010]再加上载体病毒基因有潜在致瘤和引起病毒血症的危险，这就限制了使用逆转录病毒真被转基因动物的广泛应用。
[0011]3 体细胞核移植(somatic cell nuclear transplantat1n )法
体细胞核移植(somatic cell nuclear transplantat1n )法是将体外培养的供体体细胞经外源DNA转染后，挑选出阳性转基因细胞群，再通过体细胞核移植技术和胚胎移植可最终获得转基因动物[21]的方法。虽然用该方法制作转基因动物的优点为理论上效率高达100%。但其缺点是成本之高、定点整合和核移植的效率仍然很低。目前已经由成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、卵丘细胞和乳腺细胞等转基因而获得转基因动物。Schnieke等(1998)
[22]将外源基因转染了绵羊胎儿成纤维细胞，并成功获得3头转基因绵羊，1999年扬州大学成勇[23]教授课题组由胎儿成纤维细胞成功克隆出山羊，2000年杨向中等通过体细胞核移植成年牛耳尖成纤维细胞成功克隆转基因牛，同年我国西北农林科技大学张涌教授领导的课题组培育出由成年羊耳朵皮肤细胞体细胞核移植克隆的世界首例转基因山羊，中国农业大学戴蕴平(2003)等[24]和东北农业大学刘忠华教授(2008)等[25]也分别获得转基因牛和猪。
[0012]4 胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ES 细胞)法
自1981年Evans和Kaufman宣布分离得到ES细胞[26]以来,人们对胚胎干细胞的研究日渐深入。Bradly (1984)等[27]首次证实体外培养的ES细胞能发育成生殖系嵌合体，并获得纯合体后代。刘爱民(1994)等M研究了 hprt基因在小鼠胚胎干细胞中定位致变特性。陈胜伟(1999)等_报道了由小鼠ES细胞种系成功获得嵌合体的研究，我国军事医学科学院周江等[3°]于2001年获得了国内首例Smad2条件基因打靶小鼠。
[0013]ES细胞是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立的多潜能细胞系，它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化性质，在体外培养时保持未分化状态，但在适当条件下可被诱导分化。由于其具有稳定的核型并易于诱捕外源基因，因此ES细胞进行基因敲除或定向插入外源基因的理想细胞。
[0014]该方法是首先将外源基因转染ES细胞，培养筛选出阳性细胞，将阳性细胞注入受体动物的囊胚腔，生产嵌合体动物，当ES细胞分化为生殖细胞时外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，即从第二代中获得转基因动物。这种方法可对阳性细胞进行选择，实现外源DNA的定点整合。缺点是第一代为嵌合体，许多嵌合体动物生殖细胞内不携带外源基因，即获得转基因动物的效率低并且周期长。
[0015]尽管ES细胞法成功率较高，遗传修饰能力精确，并且在细胞培养阶段就可以初次筛选，大大提高转基因的效率，但是目前只是在小鼠和人类建立了 ES细胞系，其他动物上尚未建立完善的干细胞系，还有该方法需要熟练的胚胎操作技术人员。
[0016]5 精子介导转基因(sperm-mediated gene transfer, SMGT )
Brackett (1971)等[31]将兔子的精子与用H3标记的SV40 DNA共孵育后，在精子头部检测到了放射性物质，用这些与用H3标记的SV40 DNA共孵育过的精子进行人工授精，并且在受精卵和2-细胞时的胚胎中均检测到SV40 DNA，证实外源基因既可以进入精子细胞，还能在受精后表达。遗憾的是该技术在当时并未引起人们的关注。直到1989年,等ArezzoF等[32]和Lavitrano M等[33]均报道了精子细胞能够与外源性DNA结合并产生转基因后代后，这才吸引许多学者从事这方面的研究。但是又由于Brinster R L等(1989) [34]做了重复性实验而未获得阳性结果，而使SMGT技术受到质疑。而后的几十年，研究人员通过哺乳动物、鸟类、鱼类和昆虫类做了大量的研究，证实精子可以吸附并整合外源DNA，并且携带外源性DNA进入卵细胞中。时至今日，对此技术仍然存在争论，但是利用精子作为外源基因的载体制备转基因动物仍然极为令人注目，SMGT技术有两大优点:a、能够简单、高效、快速、低廉、安全地进行转基因，其成本只有显微注射法成本的1/10 ;b、不需要对动物进行手术处理。用这种方法最早由Lavitrano M等[33]在小鼠上获得成功，至今已在家兔[35]、猪
[36]、牛[37]、羊[38]等哺乳动物上以及鸡[39?41]和鱼[42]上都相继获得成功。其方法就是利用动物精子有自发结合外源DNA的能力的特性，将成熟的精子与外源DNA进行共孵育，然后直接进行Al或IVF后体外培养后再胚胎移植，使精子携带外源DNA，与卵子受精时使外源DNA整合于受精卵的染色体中，最后轻松获得转基因动物。用SMGT技术生产转基因动物便于实验室研究和在生产中推广应用。
[0017]目前应用SMGT技术获得转基因动物主要通过体外精子转染法(精子与外源DNA直接共孵育法、脂质体介导转染法和体外电穿孔导入法等)和体内精子转染法(曲细精管注射法、睾丸内注射法等)两大途径来实现。
[0018]5.1体外精子转染法
体外精子转染法包括:精子与外源DNA直接共孵育法、脂质体介导转染法和体外电穿孔导入法等。
[0019]精子与外源DNA直接共孵育法，是在一定条件下直接将精子与裸露的外源DNA混合共孵育后，将仍然保持较好的活力且吸附有外源DNA的精子，通过体外受精或人工授精及胚胎移植等方法而获得转基因动物。在分子生物学的研究初期和体外受精技术研究初期，Brackett等(1971) [31]直接用裸露的H3标记的SV40 DNA与兔的精子孵育后，在精子头部检测到放射性物质后，经人工授精，又在受精卵和2-细胞时的胚胎均检测到SV40 DNA,首次证实外源基因可以进入精子细胞，并能在受精后的胚胎中表达。1989年，Arezzo F等
[32]和Lavitrano M等[33]等进一步证实了精子具有结合外源DNA的能力。Lavitrano[43]于2003年发现转染效率与孵育的时间、温度等条件等有关。董焕声等M (2007)利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子与外源DNA共孵育时间分别为20min、40min、60min、90min条件下,体外结合内化外源DNA的效率时,发现在60min内外源DNA与精子的结合随时间的延长而增加，90min精子的阳性率与60min差异不大。体外受精后荧光显微镜下检测2-4细胞期的胚胎有GFP散在分布强弱不均的4.7%(2/43)阳性率。王晓梅等[45](2005)金黄地鼠附睾内的精子与质粒NFkB-1u