一种沙眼衣原体的荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外核酸检测领域，本发明提供用于检测临床样品中沙眼衣原体 iracAoazaiis，简称CT)的突光定量PCR试剂盒，用于沙眼衣原体的临床早期 诊断。
【背景技术】
[0002] 沙眼衣原体iracAoaza ，CT)是衣原体属的一类，介于病毒和立克次 氏体间，能通过滤菌器，具有专性细胞内寄生与独特生活周期的原核细胞型微生物。衣原体 对黏膜上的皮细胞，尤其是柱状上皮细胞有亲和力，故易引起眼结合膜及泌尿生殖系统黏 膜感染。
[0003] 我国沙眼衣原体感染居性传播疾病（STD)的第三位，且其发病率有逐年增高的趋 势。目前，沙眼衣原体感染已经成为一个严重的社会问题。一方面衣原体已成为性病中最 常见的一种病原体，另一方面它可出现严重的持续感染现象。沙眼衣原体感染的特点之一 是大部分感染者没有明显的临床症状，最高可有70%的妇女宫颈炎和50%的男性尿道感染 是无症状的携带者，因无自觉症状，这些人在社会上是一个高危的潜在传染源。有学者报 道，经衣原体阳性母亲产道出生的婴儿，有50%_70%的机会可以获得衣原体感染，同时注射 沙眼衣原体疫苗后，可以诱发局部特异性免疫，但其保护作用仅能维持1-2年。高发病率、 高构成比是目前国内沙眼衣原体感染的基本流行概况。所以提早诊断衣原体感染有着极大 的意义。
[0004] 另外，沙眼衣原体是HIV传播的辅助因子，感染CT的女性发生HIV感染较无 CT感 染的女性高3~5倍，治疗CT可降低HIV的传播。
[0005] 医院和检测机构常规的沙眼衣原体检测方法是培养法、直接涂片法、免疫学方法， 如免疫荧光法、酶联免疫吸附法等。培养法准确可靠，但是往往需要2-3天，培养周期长， 并且操作繁琐，受样本采集方法和运输方式等影响常常导致阳性率低等缺点，已经满足不 了现代医学快速诊断治疗的步伐；直接涂片法操作简单，但是检测准确率差，依赖于主观判 断；免疫学方法如胶体金技术、酶联免疫吸附法等虽然具有简便快捷等优势，但是存在特异 性差、灵敏度低、假阳性率高等缺点，并不适合临床诊断确诊依据，只能作为初诊工具。
[0006] 近年发展起来的PCR方法则具有灵敏度高，特异性强等优点，已广泛用于核酸分 析、遗传学检测和临床检测领域。尤其是在原普通PCR的基础上，发展起来的实时荧光PCR 技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程可以 再单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，避免了 PCR后的处理，是一种先进的分子定量检测技术。荧光PCR技术有多种类型，其定量方式也 不同，主要分为荧光染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种灵敏度高、特异性好、操作简单、检测速度快的沙眼衣原体 的荧光定量PCR检测试剂盒，用于临床样本中沙眼衣原体感染的辅助诊断。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种沙眼衣原体的荧光定量PCR 检测试剂盒，试剂盒包含PCR反应液、DNA聚合酶液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控 品、阳性定量参比品、裂解液及蛋白酶K溶液，PCR反应液中包含有沙眼衣原体特异性的正 向引物、反向引物和荧光探针； 正向引物序列：5' -GCATGAGTCAGGACGAGTT-3'， 反向引物序列：5' -CGAAACTAAATGTGCGAGAGC-3'， 荧光探针序列：5'-FAM-TTAGCCACCGATGAAGACCCGTTAC-TAMRA-3'， 裂解液为 5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (pH8.0)、0.2mM EDTA(pH8.0)、l%(V/V) TritonX-100,0. 5%(V/V) NP40.0. 5%(V/V)Tween20 ； DNA聚合酶液为包含有热启动的Taq DNA聚合酶和UDG酶； 阳性质控品与弱阳性质控品为含插入沙眼衣原体特异性保守序列的质粒PCR2. 1载 体，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5 α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度 后用无菌TE缓冲液定量稀释，其中CT阳性质控品的浓度为5. OX 107C〇pieS/ml，CT弱阳性 质控品的浓度为5. OX 103copies/ml ; CT阳性定量参比品为含插入沙眼衣原体特异性保守序列的质粒pCR2. 1载体，浓度 分别为 Pl :5. OX 106copies/ml，P2 :5. OX 105copies/ml，P3 :5. OX 104copies/ml，P4 : 5. OX 103copies/ml ;阴性质控品为灭菌去离子水。
[0009] PCR反应液还包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种核苷酸和含有镁离子的缓冲液。
[0010] 本试剂盒保存于-20°c及以下，尽量减少反复冻融。
[0011] PCR反应液所包含的正向引物、反向引物和探针的衍生序列也为本发明的保护范 围，所述衍生序列为向5'端和3'方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
[0012] 所述探针序列5'端标记荧光报告基团FAM可替换为TET、JOE、HEX或VIC中的一 种；所述探针序列3'端标记的荧光淬灭基团TAMRA可替换为DABCYL或BHQ中的一种。
[0013] 本发明采用的是Taqman探针法技术，该技术相对于荧光染料嵌入技术和自身淬 灭荧光技术来说，特异性更强，同时不受引物二聚体的影响，由于不需要分析溶解曲线的步 骤，检测时间更短，因此更适合临床使用。
[0014] 本发明针对沙眼衣原体特异性基因保守序列设计特异性PCR引物，能特异性扩增 靶DNA序列从而达到临床诊断目的，可以简便快速的检测临床样本中沙眼衣原体感染，本 发明与其它检测技术相比主要优点如下： 1、 相对于常规PCR技术，本发明具有操作简便，结果明了等特点，产物不用凝胶电泳检 测，完全闭管操作，有效的减低了 PCR产物污染的风险， 2、 同时引入了 UDG酶抗污染体系，可以有效地减少产物形成的气溶胶污染而引起的假 阳性问题， 3、 检测速度快，整个实验操作仅需2~3个小时，操作简单。
[0015] 总之，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、操作简单与快速明了等特 点，是一种适用于临床样本中沙眼衣原体快速检测的试剂盒。
【附图说明】
[0016] 图1是沙眼衣原体定量检测试剂盒的线性实验数据图，图中横坐标cycle表 示扩增循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度；S1-S7分别表示浓度为5. OX Kfcopies/ ml >5. OX 107copies/ml > 5. 0 X 106copies/ml > 5. 0 X 105copies/ml >5. 0 X 104copies/ml > 5. OX 103copies/ml、5. OX 102copies/ml的阳性质控品扩增曲线，各3个重复数据；CK为阴 性质控品； 图2是根据线性实验数据拟合的该试剂盒标准曲线示意图，图中横坐标Ig质粒浓度表 示阳性参考品浓度的对数值，纵坐标CT值表示扩增循环数； 图3是沙眼衣原体定量检测试剂盒的特异性实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增 循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度；A代表CT阳性质控品扩增曲线，B代表特异性参考品扩 增曲线，特异性参考品分别为大肠埃希菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡 萄球菌、铜绿假单胞杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌与淋病奈瑟氏菌； 图4是沙眼衣原体定量检测试剂盒的阴性实验数据。图中横坐标cycle表示扩增循环 数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，A代表CT阳性质控品扩增曲线，B代表25个无菌去离子水 重复样本的扩增曲线； 图5是沙眼衣原体定量检测试剂盒的精密度实验数据图，图中横坐标cycle表示扩增 循环数，纵坐标Λ Rn表示荧光强度，S2为10份浓度为5. OX 107C〇pieS/ml的阳性参考品 扩增曲线，S6为10份