一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于酶切法检测β -酪蛋白基因型的方法。
【背景技术】
[0002]牛奶中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两种，酪蛋白在牛奶蛋白中的含量约占80%左右，乳清蛋白约占14%。牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白，α S1-酪蛋白、a S2_酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35%。
[0003]酪蛋白中含有209个氨基酸，而它至少含有13种不同的氨基酸组成，因此分为A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、1、G。目前大多数养殖奶牛生产的β _酪蛋白，主要为Al β -酪蛋白和Α2β-酪蛋白两种类型。在生物体内，β-酪蛋白会水解产生一类由4-11个氨基酸组成，起始氨基酸为酪氨酸的多肽——β -酪啡肽，BCM7 (Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-1le)就是从这类多肽中分离出来的一种类似吗啡的活性肽，它能够刺激淋巴T细胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由Al-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下产生，这是由于Α2-酪蛋白67位脯氨酸与其相邻的66位和68位的氨基酸有比较稳定的二级结构，而Al-酪蛋白67位组氨酸与邻近氨基酸的二级结构不稳定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能够导致缺血性心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症以及一些精神方面的疾病。
[0004]Al β -酪蛋白的摄入与人类疾病之间的关系主要基于流行病学研究，Al β -酪蛋白与相关疾病的危险因素数据和死亡数据主要来源于世界卫生组织。新西兰流行病学证据表明Α2牛奶比Al牛奶更有益于人类健康。McLachlan对16个国家30-69岁的男性中Al牛奶与心脏病发病率进行了调查，统计结果表明，缺血性心脏病与Al牛奶的消耗有很强的关联性(s = 0.86)。Ell1tt比较了 10个国家0-14岁儿童I型糖尿病的发病率，Al β -酪蛋白与其有较大的关联性(s = 0.726)，在冰岛，由于当地的奶牛主要为Α2奶牛，所以该地糖尿病和心脏病的发病率很低。动物学实验也表明表明，喂养Al牛奶的兔子与喂养Α2牛奶的兔子相比，胆固醇和血脂水平更高。
[0005]因此，我们需要找到一种能够有效区分Al奶牛和Α2奶牛的方法，从而使得养殖场只繁育Α2奶牛，但目前的检测方法无法检测出β-酪蛋白不同的基因型，不能保证人们喝的牛奶为Α2牛奶。
【发明内容】
[0006]鉴于目前检测β_酪蛋白基因型的方法存在的上述不足，本发明提供一种检测出β-酪蛋白不同的基因型的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法。
[0007]为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案:
[0008]一种基于酶切法检测β -酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤:
[0009]根据β -酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为:
[0010]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCA AAC C3，
[0011]下游引物:5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3，；
[0012]利用引物扩增出片段，所述片段可使Α2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；
[0013]用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
[0014]利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。
[0015]依照本发明的一个方面，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，具体为:
[0016]如果PCR扩增后的产物无法被Dde I切开或存在一个253bp的条带，则β -酪蛋白为Al β-酪蛋白；
[0017]如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个35bp的条带，则3-酪蛋白为八2 3-酪蛋白；
[0018]如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个253bp的条带，则3-酪蛋白为八认2 3-酪蛋白。
[0019]依照本发明的一个方面，所述酶切的体系包括PCR产物9ul、限制性内切酶0.2ul和缓冲液Iul ;所述酶切的条件为37°C孵育l_8h，65°C热失活20min。
[0020]依照本发明的一个方面，在β -酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述酶切的条件为37°C孵育2h，65°C热失活20min。
[0021]依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶 0.lU/ul、2.5uM dNTPlul、1uM 上下游引物各 lul、2XLengend PCR BufferlOul、加ddH20 至 20ul。
[0022]依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的条件:在温度为92_95°C时预变性5min，然后在温度为92-95°C时变性15s、在温度为52-65°C时退火30s、在温度为68_72°C时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68-72°C时延伸7min。
[0023]依照本发明的一个方面，所述PCR扩增进行35个循环。
[0024]依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的条件:在温度为95°C时预变性5min，然后在温度为95°C时变性15s、在温度为61°C时退火30s、在温度为72°C时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72°C时延伸7min。
[0025]本发明实施的优点:本发明的检测方法首先根据β -酪蛋白的碱基序列，在β -酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为:
[0026]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCA AAC C3，
[0027]下游引物:5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3，；
[0028]然后利用引物扩增出片段，所述片段可使Α2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；再用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；最后利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，本发明的检测方法利用Al β -酪蛋白与Α2β-酪蛋白67位氨基酸的第二个碱基不同，设计出特异性的引物，使Α2β-酪蛋白产生一个Dde I酶切位点，而Al β -酪蛋白没有酶切位点，然后利用酶切技术，从而有效区分出Al β -酪蛋白与Α2 β -酪蛋白，因此，本发明人提供的基于酶切法检测β -酪蛋白基因型的方法能检测出β -酪蛋白不同的基因型，从而保证人们喝的牛奶为Α2牛奶。
【附图说明】
[0029]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1为本发明所述的一种基于酶切法检测β -酪蛋白基因型的方法的示意图；
[0031]图2为本发明所述酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0032]下面将结合附图对本发明作进一步说明。
[0033]如图1、图2所示，一种基于酶切法检测β -酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤:
[0034]根据β -酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为:
[0035]上游引物:5，ACCCCA ATT TCT TAA CCAAAC C3，
[0036]下游引物:5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3，；
[0037]利用引物扩增出片段，所述片段可使Α2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；
[0038]用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
[0039]利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。
[0040]由于牛奶中蛋白质主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类，牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白:aSl-酪蛋白、aS2_酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35%，是氨基酸的重要来源，同时在体内传递重要的矿物质(如钙和磷等)，促进