一种y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒及扩增引物对和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体为生物分子诊断试剂，尤其是检测Y染色体微 缺失的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国育龄人口中不孕不育人数呈现出大规模增长，数量已超过2000万。 20年前我国育龄人群中不孕不育率仅为3%，而如今已经攀升到15%，这其中由男性不育 引起的不孕占到50%，比10年前增加了 15%。
[0003] 由于男性不育症临床表现、治疗方法和治疗效果根据发病原因的不同而存在着较 大的差异，因此男性不育症治疗的重点是要找到具体的致病原因，进行病因治疗。男性不育 症的病因有：泌尿生殖道畸形，生殖道感染，精索静脉曲张，内分泌紊乱，遗传学因素和免疫 因素等。但是目前仍有50%的患者找不到明确原因，属于特发性男性不育，其体检及内分泌 检查均正常，精液分析显示有少精、弱精和畸形精子，被称为中重度少弱精症。随着近几年 临床诊疗技术的发展，人们发现这种疾病的发生往往与个体存在着某些染色体或遗传上的 缺陷有一定关系。
[0004] Y染色体不仅是性别决定的关键因素，也在人类精子发生过程中发挥重要作用。 1976年，Tiepolo等首先报道Y染色体长臂（Yqll)常染色质区存在精子发生相关基因，称 为无精子因子（Azoospermia factor, AZF)。并由此揭开了研究Y染色体微缺失与男性不 育关系的序唇。国外研究报道，少精子症和无精子症患者约有8. 2%的Y染色体微缺失率。 其中AZF区域微缺失与男性异常生精表型密切相关，被认为是导致男性无精症与严重少精 症的最常见分子遗传学机制。AZF分为a、b、c、d四个亚区，其中与精子发生相关的基因有 DAZ(deleted in azoospermia)>DFFRY(the Y-Iinked homologue of the DFFRX)>DBY(dead box on the Y)、RBMY(RNA-binding motif Y)等。DFFRY 与 DBY 是 a 区的候选基因，而 RBMY 和DAZ则分别是b区和c区的候选基因。d区位于b区和c区之间，目前尚无任何候选基 因。
[0005] 目前Y染色体微缺失常用的检测方法主要是多重PCR扩增后电泳检测序列位点标 签（Sequence tagged sites, STS)或候选基因。尽管目前该方法已经成为Y染色体微缺失 检测的行业标准，然而仍然存在许多不足：首先电泳的方法容易造成PCR产物污染导致假 阳性；其次，该方法耗时、工序多，不利于大批量样本的检测。
[0006] 2004年欧洲男科学研究会和欧洲质量监控组织公布的Y染色体微检测指南中推 荐在每个 AZF 区域使用 2 个 STS :sY84 (AZFa)、sY86 (AZFa)、sY127 (AZFb)、sY134 (AZFb)、 sY254 (AZFc)，sY255 (AZFc)。这也是目前市面上许多商业试剂盒所检测的位点。然而，仅仅 对这6个STS检测会出现较大比例的假阴性，对Y染色体微缺失的覆盖率只有95%，且不 能判断AZF各亚区的缺失类型，从而不能很好的指导临床干预及治疗。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒，该试剂盒能稳 定、快速、准确、高通量、高覆盖地对男性Y染色体微缺失基因进行检测，且其对临床干预或 治疗的指导作用更加明确。
[0008] 本发明提供了一种检测试剂盒，其中包括了针对2004年欧洲男科协会（EAA)和欧 洲分子遗传实验质控协作网（EMQN)联合发布的Y染色体微缺失检测指南中的所有检测位 点的引物序列（SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255)，还包括了 4个中国人群缺失较多 的STS位点（SY157、SY242、SY1191、SY1291)，并包括了若干扩展分析位点。在初步筛查后， 进行扩展分析，可以真正确定a、b、c区缺失发生的情况--部分还是完全缺失。
[0009] 用于多重实时荧光PCR检测Y染色体微缺失的组合物，包括以下特征性扩增引 物对及荧光探针：用于检测a区域的SY84和SY86的扩增引物对和荧光探针，检测b区域 的SY127和SY134的扩增引物对和荧光探针，检测c区域的SY254、SY255、SY157、SY242、 SY1191、SY1291的扩增引物对和荧光探针；还包括用于检测以下位点的扩增引物对和荧光 探针：
[0010] (1)用于检测a区域（AZFa)缺失的SY82、SY88、SY1064和SY1065位点中的至少 一个；和
[0011] (2)用于检测b区域（AZFb)缺失的SY105、SY121、SY143和SY153位点中的至少 一个；和
[0012] (3)用于检测c区域（AZFc)缺失的SY160 ;和
[0013] (4)用于检测d区域（AZFd)缺失的SY145和SY152位点中的至少一个。
[0014] 优选的，还包括检测c区域的SY157、SY242、SY1191、SY1291位点的扩增引物对和 荧光探针。
[0015] 上述的荧光探针是连接荧光基团和淬灭基团的核苷酸，所述的荧光基团选自 ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5 和 CY5. 5。淬灭基团选 自DABCYL、BHQl、BHQ2、BHQ3、TAMRA和ECLIPE。荧光探针的类型可选用TaqMan探针、 TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针以及双 环探针，优选为TaqMan-MGB探针。
[0016] 优选的，所述各位点的扩增引物对和探针序列分别为：
[0017] 特异性扩增Y染色体AZF a区SY82位点的引物对，其核苷酸序列 为，上游：CTTTCTGTTTCTGAGTTGTTTTACTTGAG(SEQ ID No. I)，Tm58 °C，下游： GGATGATGGGATGTTTGGATAAATA (SEQ ID No. 2)，Tm59 °C ;SY82 荧光探针的核苷酸序列： AATTGCCTCCAGTTCTA(SEQ ID No.45)，Tm69°C。
[0018] 特异性扩增Y染色体AZF a区SY84位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO :4 所示；上游：CCCTATTTGTTTTAAGGTGCCATTC(SEQ ID No. 3)，Tm60 °C， 下游：ATCTCCAGCCCATGTTTCGT (SEQ ID No. 4)，Tm58 °C ;SY84 荧光探针的核苷酸序列： CTCTACCTCCTTCCC(SEQ ID No.46)，Tm69°C。
[0019] 特异性扩增Y染色体AZF a区SY86位点的引物对，其核苷酸序列为，上游： GGTAATGGCTTCCCAGAGTTGT(SEQ ID No. 5)，Tm58°C，下游：TCTAGCCTCAAGGACTGTGAGAATC(SEQ ID No. 6)，Tm59 °C ;SY86 荧光探针的核苷酸序列：CCAAAGACTGGGCCC (SEQ ID No. 47)， Tm70°C。
[0020] 特异性扩增Y染色体AZF a区SY88位点的引物对，其核苷酸序列为，上游： TAGCATTAATAGACCACCATGTTGTTC(SEQ ID Νο·7)，Tm59°C，下游：CCTGCCTCAGCTTCCCAAA(SEQ ID No.8)，Tm60°C;SY88 荧光探针的核苷酸序列：AGTGGCTCATGTCTGTAAT(SEQ ID Νο·48)， Tm69〇C〇
[0021] 特异性扩增Y染色体AZFb区SY105位点的引物对，其核苷酸序 列为，上游：GGTGTTGTTGGTACGAGCATAAGA(SEQ ID No. 9)，Tm59 °C，下游： ATGGATATTGCAAGTGATGTGAAAG (SEQ ID No. 10)，Tm58 °C ; SY105 荧光探针的核苷酸序列： AACCCCAGAGAGATCA(SEQ ID No.49)，Tm70°C。
[0022] 特异性扩增Y染色体AZFb区SY121位点的引物对，其核苷酸序列为，上游： TTGTGATCTTTGGCCCTGAAC(SEQ ID No. 11)，Tm59 °C，下游：GTAAGAGTTACAGAGTAGGGATCTGAG ATG(SEQ ID No. 12)，Tm59°C;SY121 荧光探针的核苷酸序列：CCTTTGAACCCAAGATG(SEQ ID No. 50), Tm70°C。
[0023] 特异性扩增Y染色体AZFb区SY127位点的引物对，其核苷酸序 列为，上游：GGCTCACAAACGA