同时扩增人常染色体和y染色体str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，涉及人类常染色体和Y染色体STR基因座的复合扩 增检验系统，具体涉及一种同时扩增人常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩 增试剂盒，可应用于法医个体识别、嫌疑人家系排查及亲权鉴定等方面。
【背景技术】
[0002] 短串联重复序列（Short Tandem R印eat，STR)是存在于人基因组中的一类具有长 度多态性的DNA序列，其核心序列一般由2~6个碱基构成，因该核心序列在不同个体间呈 不同数目的串联重复而呈现出长度多态性。人基因组DNA中平均每6~IOkb就有一个STR 基因座，这些广泛分布于人基因组中高度多态重复序列成为个体识别和亲权鉴定的有效遗 传标记，可用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)和电泳分离的方法进行 检测。
[0003] DNA-STR分型技术由于具有特异性好，灵敏度高，分型简便快速，易于标准化等优 点，自20世纪90年代以来已成为法医物证检验的主要手段之一。目前常用的STR检测试 剂盒包括常染色体STR检测试剂盒和Y染色体STR检测试剂盒，可以分别进行个体识别检 测和父系检测。当一个重大刑事案件发生时，往往会对现场提取的物证先进行常染色体STR 检测，当确认为男性犯罪嫌疑人遗留的物证时，再加做Y染色体STR检测，由此增加侦查线 索。目前国内使用最多的ABI公司生产的Y染色体STR试剂盒（Yfiler)和常染色体STR试 剂盒（Identifiler)因受到检材状态、扩增位点个数、扩增体系等因素的影响，仅两次PCR 过程就耗时5-6个小时，这样两次的检验程序往往因为增加了检测时间而延误抓获犯罪嫌 疑人的最佳机会，同时也会因为犯罪嫌疑人遗留在现场的物证量少导致检测失败，最终失 去侦查线索。总而言之，随着刑事案件的增多，现有检测试剂盒已无法很好的满足公安实战 对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求，如何实现常染色体STR基因座和Y染色 体STR基因座一起检测，达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率成为有 待解决的问题。
[0004] 本发明利用高效的热启动Taq DNA聚合酶及多色荧光技术，可以单管同时扩增34 个基因座，最终研发常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座同时检测的综合试剂盒，为 满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求提供有效的技术保障。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种同时扩增人常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标 记复合扩增试剂盒及其应用，达到缩短检测时间，提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。
[0006] 本发明为实现上述目的，采用如下技术方案实现：
[0007] 通过对 DYS549、DYS522、DYS389I、DYS439、DYS447、DYS389II、DYS392、DYS576、 DYS19、DYS388、DYS391、DYS635、DYS460、DYS456、DYS533、DYS520、DYS438、DYS527a/b、 DYS449、DYS709、DYS622、DYS481、DYS437、DYS390、DYS630、DYS448、Y_GATA_H4、DYS458、 DYS607、DYS393、DYS552、DYS570、DYS385a/b、DYS593、DYS444、DYS643、Amelogenin、vWA、 D10S1248、D2S441、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、 D22S1045、DlS1656、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSFlP0、Penta D、Penta E、THOl和TPOX共62个基因座的研究，确保所选基因座与市场主流试剂盒（ABI公司的 Identifiler和Yfiler)的基因座具有一定兼容性，即可以与已有DNA数据进行共享与交 流，最后筛选出18个Y染色体STR基因座、15个常染色体STR基因座和Amelogenin基因 座，筛选出的基因座如下：
[0008] D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1P0、D19S433、 vWA、D5S818、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、Amelogenin、DYS19、DYS385a/b、DYS389 I、 DYS389 II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYS456、DYS458、DYS635、Y_ GATAJM、DYS448、DYS527a/b。
[0009] 同时包含人类常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，试剂 盒包含上述34个基因座中的至少1个常染色体STR基因座和1个Y-STR基因座的特异性 扩增引物。
[0010] 将上述34个基因座进行分组，各组分别采用荧光染料中的一种标记，并且不同组 别标记物不同，所述荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX或者VIG。
[0011] 根据以上34个基因座，优选采用如下的基因座排布方式及化学荧光染料标记的 方法：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS448 为第一组，荧光染料标记物 为 6-FAM ;DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1P0、DYS385a/b、DYS458 为第二组，荧光染料 标记物为HEX ;DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、DYS390为第三组，荧光染料标记物 为 TAMRA ;Amelogenin、D8S1179、D5S818、DYS19、FGA、DYS438 为第四组，荧光染料标记物为 ROX。DYS393、DYS389 I、DYS439、DYS389 II、DYS392、Y_GATA_H4、DYS635 为第五组，荧光染 料标记物为VIG。
[0012] 随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越 严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量特异性的引物序列进行复杂 的测试及摸索复扩系统中引物之间特异的浓度比例，最终保证了不降低试剂盒特异性及灵 敏度的情况下复合更多的STR基因座。本发明通过复杂的测试摸索出引物序列及对应的浓 度，如表1所示。
[0013] 表1:
[0014]
[0016] 除了上述基因座的特异性扩增引物，本试剂盒反应体系还包括反应混合液、热启 动Taq酶和sdH20,所述反应混合液包含Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTPs，各组分的浓度可以 根据需要进行调整。本试剂盒各组分及其在反应体系中体积见表2。
[0017]表 2 :
[0019] 本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测 试不同的扩增程序，保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。最终扩 增程序如表3。
[0020] 表 3 :
[0022] 本试剂盒检测扩增产物的方法为毛细管电泳。
[0023] 本试剂盒具有很强的检材适应性包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提 法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类 血液或口腔细胞。
[0024] 本试剂盒应用广泛，可用于法医个体识别、亲权鉴定（被拐卖儿童、灾难中遇害者 遗体认定）及DNA家谱构建。
[0025] 有益效果：与同类试剂盒相比较，本试剂盒具有如下优势：
[0026] 1、本试剂盒可以同时检测18个Y染色体STR基因座、15个常染色体STR基因座 和Amelogenin基因座，实现常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座一起检测，达到缩 短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。
[0027] 2、本试剂盒可以同时检测18个Y染色体STR基因座、15个常染色体STR基因座和 Amelogenin基因座，基因座数量是同类试剂盒中最多。
[0028] 3、本试剂盒因为同时检测了常染色体和Y染色体STR基因座，与两种试剂盒分开 检测相比，可以节省扩增模板用量，从而在一定程度上解决案件中微量检材问题。
[0029] 4、本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不 同检材的样本包括：利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因 组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
【附图说明】
[0030] 图1.基因座分组及染色不意图；
[0031] 图2. EX16+18Y案件中血样分型图；
[0032] 图 3· EX16+18Y Ladder 分型图；
【具体实施方式】
[0033] 实施例1STR基因座的筛选
[0034] 通过对 DYS549、DYS522、DYS389I、DYS439、DYS447、DYS389II、DYS392、DYS576、 DYS19、DYS388、DYS391、DYS635、DYS460、DYS456、DYS533、DYS520、DYS438、DYS527a/b、 DYS449、DYS709、DYS622、DYS481、DYS437、DYS390、DYS630、DYS448、Y_GATA_H4、DYS458、 DYS607、DYS393、DYS552、DYS570、DYS385a/b、DYS593、DYS444、DYS643、Amelogenin、vWA、 D10S1248、D2S441、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、 D22S1045、DlS1656、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSFlP0、Penta D、Penta E、THOl和TPOX共62个基因座的基因多态性的研究，确保基因座与市场主流试剂盒（ABI 公司的Identifiler和Yfiler)的基因座具有一定兼容性，即可以与已有DNA数据进行共 享与交流的前提下，最后筛选出18个Y染色体STR基因座、15个常染色体STR基因座和 Amelogenin基因座。每个基因座相应信息如表4所示。
[0035] 表 4 :
[0036]
[0038] 实施例2试剂盒STR基因座排布
[0039] D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、DYS527a/b、DYS448 为第一组，荧光染料标记 物为 6-FAM ;DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1P0、DYS385a/b、DYS458 为第二组，荧光染料 标记物为HEX ;DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、DYS390为第三组，荧光染料标记物 为 TAMRA ;Amelogenin、D8S1179、D5S818、DYS19、FGA、DYS438 为第四组，荧光染料标记物为 ROX。DYS393、DYS389 I、DYS439、DYS389 II、DYS392、Y_GATA_H4、DYS635 为第五组，荧光染 料标记物为VIG，分组图见图1所示。
[0040] 实施例3试剂盒特异性引物设计及不同引物浓度调试
[0041 ] 随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越 严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试 及摸索复扩系统中引物之间特异的浓度比例，最终保证了不降低试剂盒特异性及灵敏度的 情况下复合更多的STR基因座。
[0042] ⑴特异性引物设计
[0043] 设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域 进行引物设计。
[0044] a.引物Tm值：由于算法不一样，不同软件设计的引物Tm值不尽相同，但需要尽可 能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2°C。
[0045] b.引物间二聚体：尽可能避免两条引物3'末端之间有连续超过3个碱基互补配 对。
[0046] c.引物与模板序列非特异结合：设计过程中尽量避免引物序列与模板序列非特 异区域结合。
[0047] d.引物比对：引物序列需要利用NCBI进行blast比对，除了特异性引物结合区 外，匹配区域越少越好。
[0048] ⑵引物验证
[