抑肽酶衍生的多肽-抗体缀合物的制作方法
【专利说明】抑化酶衍生的多化-抗体缀合物
[000。 相关申请的引用
[0002] 本申请要求于2012年11月12日提交的美国临时专利申请号61/725, 365的优先 权日的权益。运个早期提交的临时申请的内容W其全部内容结合于本文中作为参考。
技术领域
[0003] 本发明设及其中一种或多种Kunitz型蛋白酶抑制剂（例如，抑肤酶酶）或其衍生 物（例如，抑肤酶衍生的多肤）W本文中的方式缀合至抗体部分的蛋白缀合物；缀合物藉此 合成用于药物用途或诊断用途（例如，用作成像试剂）的方法；包含它们的生理可接受组合 物；W及将缀合物给药于患者用于，例如，癌症和神经功能障碍的诊断和治疗的方法。
【背景技术】
[0004] 尽管血脑屏障度BB)保护中枢神经系统（CN巧不受有害物质（例如，意外摄入毒 素）侵害，但它也阻止治疗性蛋白接近大脑和脊髓，因此，在治疗CNS的病症中设置了主要 障碍。一般来说，仅仅小于约500道尔顿的亲脂分子穿过BBB。许多在CNS疾病的动物研究 中表现出有前景结果的药物都比此大得多，而蛋白治疗剂通常由于脑毛细血管内皮壁对那 种尺寸和复杂性的药物的渗透性可W忽略不计而一般从中枢神经系统排除。
[0005]目前增强蛋白质治疗剂递送至中枢神经系统的策略能够分为=类。第一类包括创 伤性方案，如药物的直接脑室内给药和暂时中断BBB的高渗性溶液内颈动脉灌注。第二类 包括旨在通过BBB提高蛋白质脂溶性的药理学基的策略。在第S类中是递送方案，其中治 疗剂连接于一种相对于BBB起到载体或受体-祀向的递送载体作用的蛋白。运种方法的优 点在于，它是高度特异性的和高效的，导致不利影响最小，并且适用广泛。
【发明内容】
[0006] 在第一方面中，本发明特征在于包含抗体部分和一种或多种Kunitz型蛋白酶抑 制剂（例如，抑肤酶）或其衍生物（例如，抑肤酶衍生的多肤）的蛋白缀合物。抗体部分和 将缀合物传送通过BBB的多肤二者都将在W下进行详细讨论。蛋白缀合物能够通过接头的 内含物；通过缀合至每一抗体部分的多肤的数目；和/或通过抗体部分和多肤发生缀合的 位置进一步定义。而且，在给定的缀合物中，在含有不只一个多肤的情况下，每个多肤仅仅 连接至抗体部分。换句话说，没有多肤经由接头或另外方式连接至缀合物中的另一多肤。
[0007] 在一个实施方式中，蛋白缀合物包含抗体部分和包含氨基酸序列化ri-Phe2-Phe3- TyrA-Glys-Glye-Cysy/Sery-Ar邑s-Glyg-Lysi〇-Ar邑ii-Asni2-Asni3-Phei4-Lys巧一Thrie-Glun-Glui 片>'19佛9 10歌117)或生物活性类似物或569 10歌117的片段的多肤。正如由"切37/Ser/'所示，在位置7的氨基酸残基能够是半脫氨酸或丝氨酸。在包含运种多肤（SEQID NO: 117)或任何其它本文中的多肤的蛋白缀合物中，抗体部分能够在多肤的一个或多个W 下位置缀合至多肤：N-端氨基酸残基（例如，T虹1，其中多肤由SEQIDN0:117组成）；C-端 氨基酸残基（例如，Tyrw其中多肤由SEQIDNO: 117);或N-端和C-端之间的赖氨酸残基 (例如，沈QIDNO: 117 中的Lysi。或Lys15)。
[0008] 我们使用术语"蛋白质缀合物"是指由分子禪合部分形成的氨基酸基化合物。在 本发明中，部件包括抗体部分和由其（例如，通过接头）禪合的一个或多个多肤。"氨基酸 基的化合物"是指主要包括，但不一定完全是氨基酸残基的化合物（即，仅包含氨基酸残基 (如在常规融合蛋白中的情况）的化合物或包含氨基酸残基和其它构件的化合物）。正如 上面所提及，蛋白缀合物能够包含接头，其可W是化学化合物。运种缀合物将主要包括，但 非唯一地是，氨基酸残基，因为抗体部分与多肤是由氨基酸构成而接头是化学化合物。蛋白 缀合物还可W包括检测剂（例如，巧光体、放射性同位素、染料等）。可检测的试剂可W不包 括氨基酸残基，W及在运种情况下，我们也可W是指一种含有运些检测剂作为氨基酸基化 合物的蛋白缀合物。本发明还涵盖在诊断方法，包括诊断成像中使用可检测的缀合物的方 法。
[0009] 为了更加清楚起见，我们注意到，抗体部分与一个或多个多肤彼此区别（即，它们 是彼此不相同的）。然而，任何蛋白质缀合物能够包括不只一个多肤，而两个、=个、四个或 更多个多肤可W是相同的（即，可W具有相同的氨基酸序列）或可W彼此不同（即，缀合至 抗体部分的多肤可W有不同的氨基酸序列）。关于本发明的组合物和方法，我们使用了术 语"包含"意指"含有"。例如，在W上的实施方式中，蛋白缀合物包含抗体部分和依次含有 由SEQIDNO: 117表示的氨基酸序列的多肤。在任何情况下，除非上下文另外特别指明，否 贝1J，本发明的组合物，其组成部分（例如，抗体部分和多肤）和本发明的方法能够包含所引 述的要素或步骤或由其组成。例如，给定的多肤能够包含所引述的序列（例如，SEQIDNO: 117)或由所引述的序列组成。
[0010] 正如W上所示，本发明的蛋白缀合物能够包括如本文的多肤或生物活性类似物或 其片段。我们关于蛋白缀合物的多肤部分使用了术语"生物活性"是指所引用的多肤的类 似物或片段在有用的生理设置中保留了足够活性。由于蛋白缀合物的多肤部分负责传送缀 合物和/或多肤连接的抗体部分穿过BBB，则所引述的多肤的类似物或片段在其有能力传 送缀合物和/或多肤连接的抗体部分穿过BBB时也是生物活性的。运个属性能够在体内或 体外模型中进行测试，而所引述的多肤的生物活性类似物和片段可能在此转运中比引述的 多肤更加有效或不太有效。具体而言，片段或类似物只要它保持足够高活性而实现所需结 果（例如，只要其中包含的缀合物实现临床上有益的结果）时其功效可W比所引述的多肤 功效低。
[0011] 所引述多肤的"片段"是所引述多肤的连续或紧邻部分（例如，多肤十个氨基酸长 的片段能够是那个多肤中任意2-9个近邻残基（contiguousresi化es))。所引述多肤的 "类似物"是具有类似于，但不相同于所引述多肤或其部分之序列的序列的任何多肤。因此， 包含一个或多个氨基酸取代、插入或氨基酸残基的缺失（或其任何组合）的多肤就是所引 述序列的类似物。适合包含于本发明蛋白缀合物中的多肤的片段和类似物进一步描述如 下。
[0012] 如所示，本发明的任何蛋白缀合物能够包括缀合物的抗体部分和一个或多个多肤 之间的接头。缀合物能够通过本领域内已知为"点击化学（clickchemis付y)"的方法进行 组装。或许点击反应的最突出的实例是铜-催化的叠氮化物-烘环加成反应（CuAAC)，而 该反应能够用于生成本发明的缀合物。运些反应在体内是有用的，因为叠氮化物或端烘官 能团通常都存在于自然系统中。尽管基于CuAAC的点击化学具有引人入胜的特点，但铜可 能阻碍活体细胞或整个生物内的生物正交缀合，而本发明的方法也能够采用无铜点击化学 (即，本发明本缀合物能够采用无铜点击化学进行组装）。
[0013] 在一些实施方式中，接头是包含与伯胺具有反应活性的基团的化学化合物。因此， 接头能够是单氣化环辛烘（MFC0)、双环化1. 0]壬烘度CN)、N-班巧酷亚胺基-S-乙酷基 硫代乙酸醋（SATA)、N-班巧酷亚胺基-S-乙酷基硫代丙酸醋（SATP)、马来酷亚胺或二苯并 环辛烘值BC0)。合适的接头和将其引入本发明的缀合物中的方法W下进一步进行描述。
[0014] 在由SEQ ID NO: 117表示的多肤中，在编号位置7处的残基能够是半脫氨酸残基 或丝氨酸残基，而运种取代能够在本文中的任何多肤中进行。因此，有用的多肤能够包括氨 基酸序列化Ti-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly日-切S7-Args-Glyg-Lysin-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Ly S巧虹i6-Glui7-Gluis-Ty；Tig(SEQ ID NO:67)，氨基酸序列虹 1-Phe2-Phe；5-Tyr4-Gly5-Gly6-Se fy-Ar邑8-G1y9-Lysi〇-Ar邑u-Asni2_Asni3-Phe"-Lys巧一Thrie-Glun-Gluis-Tyrig (SEQ ID N0:97)， 或由SEQ ID N0:67或SEQ ID N0:97表示的多肤的生物活性片段或类似物。为了易于阅读， 我们在每个可能情况下将不会重复短语或其生物活性片段或类似物。应该理解的是在所引 述多肤是有用的情况下，生物活性片段或其类似物也是有用的。
[0015] 在蛋白缀合物包括SEQIDNO: 117的类似物，该类似物能够含有至少13个相对 于SEQIDNO: 117是无变化的氨基酸残基（例如，13-19个氨基酸残基，包括13和19个在 内）。由于类似物可W包括其它氨基酸残基，则类似物可W比SEQIDNO: 117的19个氨基 酸残基长。无论长度或是差异的精确本质，相似度能够表达为类似物的序列和所引述的多 肤（本文中，SEQIDN0:117)的序列之间的"同一性百分比"。按照运种方式表征的类似物 进一步在W下进行描述。在多肤是SEQIDNO: 117的类似物的任何情况下，在编号位置10 的赖氨酸残基和/或编号位置15的赖氨酸残基能够保持不变。目P，类似物能够在位置10 处和/或在位置15处包含赖氨酸残基。本领域的普通技术员将会意识到，给定残基的绝对 位置可W在某些情况下进行变化。例如，如果类似物包含多于或少于SEQIDNO: 117的第9 个氨基酸残基，则刚才提及的赖氨酸残基将会出现在等同于位置10和/15的位置。例如， 在N-端包含一个其它氨基酸残基的类似物中，在所引述的序列的位置10和15处的赖氨酸 残基将会出现在类似物的位置11和16处。
[0016] 在沈QIDNO: 117的其它类似物中，Asni2能够用Gin取代，Asn13能够用Gin取代， 和/或化614能够用了7'或1'巧取代。在569 10^:117的其它有用的类似物中，半脫氨酸 残基加入到多肤的氨基和/或簇基端的末端。无论位置是SEQIDNO: 117的位置1上的苏 氨酸残基，SEQIDNO: 117的位置19上的酪氨酸残基，或是从多肤的氨基-和/或簇基端 末端缺失一个或多个残基产生的残基内部的残基，半脫氨酸残基都能够加在端位置上。换 言么N-和/或C-端半脫氨酸残基能够添加到全长多肤或其片段或类似物上。有用的类 似物能够包括序列：Phe3-Tyr4-Gly日-Glye-切Sy/Sery-Args-Glyg-LysiD-Argii-Asniz-Asnis-Ph ew-Lysi日-T虹le-Glun-Gluis-Tyr"-切S(沈QIDN0:118) ;Gly日-Glyg-Ser^-Args-Glyg-Lysio-A rgu-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi5_T虹le-Glu口-G1Uis-Tyr。-切s(SEQIDN0:119) sSer^-Arg厂G1 y厂Lysi〇-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi5-T虹i6_G1u口-Glui厂Tyr。-切s (沈QIDN0:120);Glyg -Lysi〇-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi日-T虹ig-Glun-Gluis-Tyrig-切s(SEQIDN0:121);或Lys i〇-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi日-Tyr。-切s(沈QIDN0:122)。我们已经对我们已有的氨基 酸残基进行了编号而使之在类似物如何设及SEQIDNO: 117时更加显而易见。例如，化63是SEQIDNO: 117的第S氨基酸残基，但是，显而易见是，由SEQIDNO: 118表示的SEQID NO: 117的类似物中的第一氨基酸残基。
[0017] 在蛋白缀合物包含SEQIDNO: 117的片段的情况下，片段能够包含SEQIDNO: 117 的至少6个（例如，6~18,包括6和18个在内）近邻氨基酸残基。例如，片段能够包括或 包含序列Lysi〇-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi日（SEQIDNO:。3)。
[0018] 在任何实施方式中，多肤能够包括W D-形式、k形式，或运两种形式的氨基酸残 基。例如，一个或多个（并高达全部的残基）能够是形式或D-形式。
[0019] 关于蛋白缀合物的构型，缀合物能够包括一个抗体部分和，与其连接的，不同数目 的多肤。多肤的数目将由抗体部分上合适的连接点的数目决定。由于本文中的接头能够与 伯胺基团反应，则接头可W在抗体部分中的一个或多个赖氨酸残基处将多肤连接至抗体部 分。另外，接头也可W与抗体部分上的琉基基团或糖类基团反应（而因此与之连接）。接头 可W定位于少至1-10个赖氨酸残基（即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个多肤能够缀合于抗体 部分的明显不同的赖氨酸残基处。在具体的实施方式中，约15 (例如，14-16)、约30、约40、 约50、约60、约70、约80或约90个赖氨酸残基可W占据。缀合物中的多肤数目也能够表示 为抗体部分中可用于缀合的残基数目的百分数。更具体而言，约10%至高达100%的赖氨 酸残基能够缀合至多肤。
[0020] 在任何实施方式中，抗体部分能够是IgG的类别。在任何实施方式中，抗体部分能 够是四聚体抗体，单链抗体（scFv)，四聚体抗体的片段（例如，Fab片段、F(ab')2片段）或 任何运些抗体部分的生物活性变体。我们关于蛋白缀合物的抗体部分使用了术语"生物活 性的"是指抗体的变体保持了有用的生理设置中的足够活性。由于蛋白缀合物的抗体部分 选择性地结合生物祀，所引述的抗体部分的变体，当其有能力选择性地结合祀至有用程度 时，则是生物活性。抗体部分的生物活性变体对生物祀（例如，细胞受体）可W具有与所引 述的抗体部分不同的亲和性。亲和力只要其维持足够高而实现所需的结果（例如，只要包 括它的缀合物获得临床受益的结果），则可W比所引述的抗体部分的更低。
[0021] 抗体部分能够是人的、嵌合的或人源化的抗体部分或其生物活性变体。为了易于 阅读起见，我们将不会在每个场合下都重复短语"或其生物活性变体"。应该理解的是，抗 体部分适用于本发明的上下文中，其生物活性变体也是有用的。抗体部分能够是单克隆抗 体或多克隆抗体，由单克隆或多克隆抗体构建的单链抗体、或单克隆或多克隆抗体的片段 (例如，Fab或F(ab'）2片段）。
[0022] 关于祀，抗体部分（例如，四聚体抗体、其生物活性变体、scFv、F油片段或F(油'）2 片段，或其生物活性变体，无论类别（即，无论是IgG类别或其它类别）和是否是人的、人源 化的、嵌合的、单克隆的或具有本文中的任何其它属性或特性）能够特异性地结合生长因 子受体或细胞因子受体（例如，白细胞介素受体）。生长因子受体能够是通过表皮生长因子 巧G巧家族的成员结合的受体。对于EGF家族中的蛋白的受体实例包括EGF受体巧GFR)、 肝素结合的类EGF生长因子受体化B-EGFR)、双调蛋白受体（AR)、表皮调节素受体巧PR)、 巧igen受体、P细胞素受体、和神经调节蛋白的受体（例如，神经调节蛋白-1、神经调节蛋 白-2、神经调节蛋白-3、或神经调节蛋白-4的受体）。尽管本发明并未如此限制，但当EGFR 被祀向时，抗体部分能够是曲妥珠单抗，西妥昔单抗，或帕尼单抗，含有曲妥珠单抗、西妥昔 单抗或帕尼单抗的重链和轻链的可变域的scFv，或运些四聚或单链抗体的生物活性变体。 例如，曲妥珠单抗、西妥昔单抗、或帕尼单抗的Fab或F(ab' )2片段。我们已经对具有与曲 妥珠单抗具有约99%同源性的序列的抗体进行了研究