同的 匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应理解，在氨基酸序列A 的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％ 氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是用 ALIGN-2计算机程序按前一段落中所述获得。
[0031] 本领域普通技术人员可W容易地测定杂交反应的"严格性"，其一般是取决于探针 长度、洗涂溫度和盐浓度的经验计算。一般而言，较长的探针需要较高的溫度进行适当的 退火，而较短的探针需要较低的溫度。在互补链存在于低于它们的解链溫度的环境中时， 杂交一般取决于变性DNA再退火的能力。所希望的探针与可杂交序列间的同源性程度越 高，可W使用的相对溫度越高。结果，它遵循较高的相对溫度将趋向于使得反应条件更严 格，而较低的相对溫度将趋向于使得反应条件更不严格。杂交反应的严格性的其他详情和 角军释参见Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyInterscience Publishers, (199f5)。
[0032] 通过W下那些来鉴别本文所定义的"严格条件"或"高严格性条件"：（1)利用低 离子强度和高溫进行洗涂，例如，0. 015M氯化钢/0. 0015M巧樣酸钢/0. 1 %十二烷基硫 酸钢于50°C;(2)杂交期间利用变性剂，如甲酯胺，例如，含0. 1%牛血清白蛋白/0. 1% Ficoll/0. 1%聚乙締化咯烧酬/含750mM氯化钢、75mM巧樣酸钢的抑6. 5的50mM憐酸钢缓 冲液的50% (v/v)甲酯胺于42°C;或（3)在利用50%甲酯胺、5XSSC(0. 75M化C1、0. 075M 巧樣酸钢）、50mM憐酸钢（pH6. 8)、0. 1%焦憐酸钢、5XDenhar化'S溶液、超声处理的娃精 DNA(50i^g/mL)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖的溶液中42°C过夜杂交，在0.2XSSC(氯化 钢/巧樣酸钢）中42°C洗涂10分钟，然后是由含邸TA的0. 1XSSC、55°C组成的10分钟高 严格性洗涂。
[0033] 可W按照Sambrook等，MolecularCloning:AL油oratoryManual,化W York:ColdSpringHarborPress, 1989所述鉴定"中等严格条件"，且其包括使用严格性 低于上文所述的那些的洗涂溶液和杂交条件（例如溫度、离子强度和％SD巧。中等严格条 件的实例是在包含20%甲酯胺、5XSSC(150mM化Cl、15mM巧樣酸S钢）、50mM憐酸钢（pH 7. 6)、5XDenhar化'S溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切娃精DM的溶液中37°C过 夜解育，然后在约37-50°C下在1XSSC中洗涂滤膜。熟练的技术人员将理解如何根据需要 调节溫度、离子强度等，W适应诸如探针长度等的因素。
[0034] "组织样品"或"组织碎片"意指从对象或个体的组织获得的相似的细胞的收集。 组织样品或组织碎片的来源可W是固体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官、组织样 品、活检组织和/或吸出物；血液或任意血液组分，如血浆；体液，如脑脊液、羊水、腹水或组 织液；来自个体妊娠或发育的任意时间的细胞。组织样品或组织碎片也可W是原代或培养 的细胞或细胞系。可选地，组织样品或组织碎片获自患病组织/器官。组织样品可w包含 并非在自然界中与组织天然混合的化合物，如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗 生素等。
[0035] 本文所用的"参考样品"、"参考细胞"、"参考组织"、"对照样品"、"对照细胞"或"对 照组织"指用于比较目的的样品、细胞、组织、标准或水平。在一个实施方案中，参考样品、 参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自同一对象或个体的身体的健康和 /或未患病部分（例如组织或细胞）。例如，邻近患病细胞或组织的健康和/或未患病细胞 或组织（例如邻近肿瘤的细胞或组织）。在另一实施方案中，参考样品获自同一对象或个体 的身体的未处理组织和/或细胞。还在另一实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对 照样品、对照细胞或对照组织获自不是该对象或个体的个体的身体（例如组织或细胞）的 健康和/或未患病部分。还在另一实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、 对照细胞或对照组织获自不是该对象或个体的个体的身体的未处理组织和/或细胞。
[0036] 本文所用的术语"基本相同"指两个数值之间的相似度足够高，使得本领域技术人 员可认为两个值之间的差异在通过该值（例如Kd值或抑制）测量的生物学特征的背景内 几乎没有或没有生物学和/或统计学意义。作为参考/比较值的函数，两个值之间的差异 例如小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%和/或小于约10%。
[0037] 本文所用的短语"实质性不同的"指两个数值之间的差异程度足够高，使得本领域 技术人员可认为两个值之间的差异在通过该值（例如Kd值或抑制）测量的生物学特征的 背景内具有统计学意义。作为参考/比较分子的值的函数，两个值之间的差异例如大于约 10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%和/或大于约50%。
[0038] 药物的"有效量"指在必要的剂量和时间下对达到希望的治疗或预防结果有效的 量。
[0039] "患者"、"个体"或"对象"是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物（例如 牛、绵羊、猫、狗和马）、灵长类（例如人类和非人灵长类，如猴）、兔和晒齿类（例如小鼠和 大鼠）。在某些实施方案中，该患者、个体或对象是人。
[0040] "降低或抑制"意指引起 20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%或更大的整体减少的能力。降低或抑制可W指所治疗的障碍的症状、转移的存在 或大小、或原发性肿瘤的大小。
[0041] 如本领域技术人员所理解，本文提到"约"某个值或参数包括（和描述）指向该值 或参数本身的实施方案。例如，提到"约X"的描述包括"X"的描述。
[0042] 应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括由该方面和实施方案组成和/ 或基本由该方面和实施方案组成。除非另有说明，本文所用的单数形式"一"、"一个"和"该" 包括复数指代物。
[0043] II.方法和用途
[0044] 本文提供用于液体培养干细胞的方法。本文提供在液体中培养上皮干细胞和来自 含有上皮干细胞的小肠、结肠、胃和膜的分离碎片，同时保持保留了未分化表型和自维持能 力的干细胞的存在的方法。例如，按照本文所述方法培养的分离的隐窝发育为隐窝-绒毛 类器官，该类器官包含W绒毛样上皮为衬里的中央腔。所得到的类器官经历了多重隐窝分 裂事件。令人惊奇地，本文提供的方法允许使单个分离的上皮干细胞在低水平胞外基质的 存在下在细胞培养基中派生为隐窝-绒毛类器官。分离自胃幽口区的胃碎片表现得如肠隐 窝类器官：在低水平胞外基质中，该单元开放的上部封闭，腔内充满调亡细胞，类器官经历 持续的出芽事件（表明腺体分裂），同时维持其具有中央腔的极性。 W45] 具体而言，本文提供用于液体培养（a)上皮干细胞和/或化）分离的包含上皮干 细胞的上皮组织碎片的方法，该方法包括在液体细胞培养基中解育上皮干细胞和/或分离 的组织碎片，该液体细胞培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向该基础培养 基加入（i)骨形态发生蛋白度M巧抑制剂、（ii)促细胞分裂生长因子、（iii)Wnt激动剂和 (iv)至少约4%w/v的胞外基质巧CM)。此外，本文提供用于获得和/或培养隐窝的方法， 该方法包括在液体细胞培养基中解育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞培养 基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向该基础培养基加入（i)骨形态发生蛋白 度M巧抑制剂、（ii)促细胞分裂生长因子、（iii)Wnt激动剂和（iv)至少约4%w/v的胞外 基质巧CM)。
[0046] 干细胞见于成体动物的许多器官中，保留未分化表型，它们的后代可W向存在于 相关组织中的所有谱系分化，它们终生保留自维持能力，且它们能够在损伤后再生相关组 织。干细胞驻留于特化位置干细胞巢（niche)中，干细胞巢提供适当的细胞-细胞接触，并 发出维持干细胞群体的信号。
[0047] 上皮干细胞能够形成组成上皮的不同细胞类型。一些上皮（如皮肤或肠）显示快 速细胞更新，表明驻留干细胞必须持续增殖。其他上皮（如肝或膜）在正常条件下显示非 常慢的更新。可W通过技术人员已知的流程从十二指肠、小肠和大肠（包括空肠、回肠和结 肠）及胃幽口区分离隐窝。例如，可W通过用馨合剂解育分离的组织来分离隐窝，该馨合剂 将细胞从其与基膜和基质细胞类型的巧和儀依赖性相互作用中释放出来。洗涂组织后，用 载玻片从粘膜下层刮下上皮细胞层并绞碎。然后在膜蛋白酶或更优选邸TA和/或EGTA中 解育，并用例如过滤和/或离屯、步骤将未消化的组织碎片和单细胞从隐窝分开。可W用其 他蛋白水解酶（如胶原酶和/或中性蛋白酶I)代替膜蛋白酶。用相似的方法来分离膜和 胃的碎片。
[0048] 从上皮组织分离干细胞的方法为本领域已知。在一些实施方案中，该方法包括分 离在其表面表达Lg巧和/或Lgr6的干细胞，Lg巧和/或Lgr6属于大的G蛋白偶联受体 (GPCR)超家族。在一些实施方案中，该方法包括从上皮组织制备细胞悬液，使细胞悬液与 Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触，分离Lgr5和/或Lgr6结合化合物，并从结合化合物分 离干细胞。在一些实施方案中，可W从分离的隐窝机械产生包含上皮干细胞的单细胞悬液。
[0049] 在一些实施方案中，Lg巧和/或Lgr6结合化合物包含抗体，如特异性识别和结合Lg巧或Lgr6的胞外域的单克隆抗体，如包括小鼠和大鼠单克隆抗体的单克隆抗体。使用运 种抗体，可W例如借助磁珠或通过索光激活细胞分选来分离表达Lg巧和/或Lgr6的干细 胞。在一些实施方案中，从隐窝、胃碎片或膜碎片分离上皮干细胞。例如，从分离自肠的隐 窝分离上皮干细胞。在一些实施方案中，从小肠（包括十二指肠、空肠和回肠）、膜或胃分离 上皮干细胞。
[0050] 在任意方法的一些实施方案中，该上皮干细胞和/或上皮组织碎片是胃肠干细胞 和/或胃肠组织碎片。在一些实施方案中，该胃肠干细胞和/或胃肠组织碎片是小肠干细 胞和/或小肠组织碎片。
[0051] 细胞巢部分由干细胞和周围细胞及巢中细胞所产生的胞外基质巧CM)决定。在一 些实施方案中，分离的隐窝或上皮干细胞附着于ECM。ECM由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋 白组成，其中糖蛋白包含胶原、触觉蛋白（巢蛋白）、纤连蛋白和层粘连蛋白。ECM由结缔组 织细胞分泌。已知不同类型的ECM，其包含不同组合物，该组合物包括不同类型的糖蛋白和 /或糖蛋白的不同组合。在去除运些细胞和加入分离的隐窝或上皮干细胞之前，可W通过在 容器中培养产ECM细胞（例如成纤维细胞）来提供ECM。产胞外基质细胞的实例是：主要 产生胶原和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产生IV型胶原、层粘连蛋白、间质前胶原和纤连蛋 白的成纤维细胞，及主要产生胶原（I、III和V型）、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连 蛋白和生腫蛋白-C的结肠肌成纤维细胞。备选地，ECM是市售的。市售胞外基质的实例是 胞外基质蛋白（Invitrogen)和Matrigel? 度DBiosciences)。
[0052] 在一些实施方案中，该ECM包含至少两种不同糖蛋白，如两种不同类型的胶原或 胶原和层粘连蛋白。ECM可W是合成的水凝胶胞外基质或天然存在的ECM。最优选的ECM 由Matrigel?度DBiosciences)提供，其包含层粘连蛋白、巢蛋白和胶原IV。
[0053] 在任意方法的一些实