微阵列可用于例如下一代测序、突变分析、绘制表达谱、诊断疾病等。例如，在一些实施方案中，提供了产生多核苷酸微阵列的方法，其中所述方法包括:1)通过以下过程由靶多核苷酸产生单链多核苷酸群:(a)在复合体中延伸RNA引物，所述复合体包含:⑴含有与所述靶多核苷酸互补之序列的DNA模板，和(ii)RNA引物，其中所述RNA引物与所述DNA模板杂交；和(b)用从RNA/DNA杂合体切割RNA的酶切割所述RNA引物，以使得另一 RNA引物与所述DNA模板杂交并通过链置换来重复引物延伸，从而产生单链多核苷酸群；以及2)将所述单链多核苷酸连接至固体支持物。
[0104]在一些实施方案中，提供了产生多核苷酸微阵列的方法，其中所述方法包括:1)通过以下过程由双链DNA产生单链多核苷酸群:(a)使所述双链DNA变性；(a)使RNA引物与所述双链DNA的一条链退火；(b)通过引物延伸反应使所述RNA引物延伸；(c)用从RNA/DNA杂合体切割RNA的酶切割所述RNA引物，以使得另一 RNA引物与同一 DNA链杂交并通过链置换来重复引物延伸，从而产生单链多核苷酸群；以及2)将所述单链多核苷酸连接至固体支持物。
[0105]在一些实施方案中，提供了产生多核苷酸微阵列的方法，其中所述方法包括:1)通过以下过程由单链RNA产生单链多核苷酸群:(a)将所述单链RNA逆转录成单链DNA模板；(b)使RNA引物与DNA模板退火；(c)通过引物延伸反应延伸所述RNA引物；(d)用从RNA/DNA杂合体切割RNA的酶切割所述RNA引物，以使得另一 RNA引物与同一 DNA链杂交并通过链置换来重复引物延伸，从而产生单链多核苷酸群；以及2)将所述单链多核苷酸连接至固体支持物。
[0106]II1.分析多核苷酸的方法
[0107]在一些实施方案中，本文中所述的方法包括分析多核苷酸。所述分析可包括但不限于多核苷酸测序、突变分析、多态性确定等。本文所述方法特别地可用于鉴定多核苷酸样品中的突变、预测个体对药物的响应性、预测个体中药物的药代动力学、预测个体中治疗的治疗结果。所述方法还可用于遗传测试，例如，用于产前筛查的遗传测试。
[0108]多核苷酸可通过任何分析方法来进行分析，包括但不限于例如DNA测序(使用Sanger、焦磷酸测序或者 Roche/454、Helicos、Illumina/Solexa 和 ABI (SOLID)的测序系统)、聚合酶链式反应测定、珠阵列测定、引物延伸测定、酶错配切割测定、分支杂交测定、NASBA测定、分子信标测定、循环探针测定、连接酶链式反应测定、侵入性切割结构测定、ARMS测定或夹心杂交测定。可测序或分析多核苷酸分子相对于参照序列之SNP或其他差异的存在。
[0109]在一些实施方案中，通过本文所述方法产生的多核苷酸可用于对包含两种或更多种SNP的染色体区进行NP单倍型分析，富集用于配对端测序方法的DNA序列，产生用于长阅读序列的靶片段，分离倒位、缺失和易位断裂点，对整个基因区域(外显子和内含子)进行测序以发现引起异常剪接或调控的突变，以及产生用于染色体成像(如B1nanomatrix、光学作图或基于纤维-FISH的方法)的长探针。
[0110]多态性，特别是单核苷酸多态性(“SNP”)，基本上随机地分布在整个基因组中。多态性可以是任意长度序列的插入、缺失、重复或重排，包括单核苷酸缺失、插入、或碱基改变。多态性可以是天然的，或者其可与变体表型有关。使用本文所述方法，例如通过富集目的序列，允许在群体的不同个体中或者甚至在来自单一个体的不同样品中基本上可重复地获得复杂性基本类似降低的亚群。由于多态性基本上随机地分布在整个基因组中，因此复杂性降低的核酸序列群中将存在多种多态性序列。可对这种复杂性降低的亚群进行分析以鉴定多态性或确定亚群内多态性基因座的基因型。
[0111]本文所述方法还可用于例如药物基因组学领域，其试图使多态性基因座的特定等位基因的知识与群体中个体响应于特定药物的方式相关联。粗略估计，对于每种药物，10%至40%的个体没有最佳响应。为了产生给定药物的响应谱，必须使接受所述药物的那些个体中关于多态性基因座的基因型与所述药物的治疗结果相关联。这通常通过对大量多态性基因座进行分析来进行。一旦通过分析群体中的多态性基因座估计了遗传药物响应谱，就能够确定临床患者关于与对特定药物的响应有关的那些基因座的基因型。因此，能够鉴定大量个体中的大量多态性基因座的序列对于建立药物响应谱和鉴定用于临床应用的个体基因型都很重要。
[0112]可使用Illumina测序方法来对使用本文所述方法产生的多核苷酸进行测序分析。Illumina测序方法包括桥式扩增技术，其中在SBS之前使用与固相结合的引物来延伸和扩增溶液相单链核酸(参见，例如 Mercier 等(2005) “Solid Phase DNA Amplificat1n:ABrownian Dynamics Study of Crowding Effects, b1physical Journal 89:32-42 ；Bing等(1996) “Bridge Amplificat1n:A Solid Phase PCR System for the Amplificat1nand Detect1n of Allelic Differences in Single Copy Genes.”Proceedings of theSeventh Internat1nal Symposium on Human Identificat1n, Promega Corporat1nMadison，ffl.)0
[0113]Illumina测序技术需要制备侧翼为配对端接头序列的单链核酸。每个配对端接头均包含独特的引物杂交序列。使核酸分布在包被有单链寡核苷酸的流动池(flow cell)表面上，所述单链寡核苷酸对应于单链核酸侧翼接头上存在的引物杂交序列。使接头连接的单链核酸与流动池表面结合并暴露于用于基于聚合酶之延伸的试剂。引发(prime)随着连接片段的游离端/远端与表面上的互补寡核苷酸“桥连”而发生，并且在退火步骤期间，来自一个结合引物的延伸产物与另一结合引物形成第二桥链。重复的变性和延伸导致了单个分子在数百万的独特位置中的局部扩增，从而跨流动池表面产生克隆“簇(cluster) ”。
[0114]然后，将流动池放置在测序模块内的射流盒(fluidics cassette)中，向其中添加引物、DNA聚合酶和荧光标记的可逆终止核苷酸(例如A、C、G和T)，以允许将单个核苷酸并入每个簇的每个克隆DNA中。在每个并入步骤之后，对整个流动池进行高分辨率成像以鉴定流动池上每个簇位置处并入的核苷酸。在成像步骤之后，进行化学步骤以使并入的核苷酸的3’端解封闭(deblock)，以允许随后并入另一核苷酸。进行重复循环(iterative cycle)以产生一系列图像，每张图像表示特定簇上的单碱基延伸。该系统通常产生多至20至50个核苷酸的序列读取。关于这种测序系统的更多细节在例如Bennett 等(2005) “Toward the I, OOOdollars human genome.，，Pharmacogenomics 6:373-382 ;Bennett，S.(2004) “Solexa Ltd.” Pharmacogenomics 5:433-438 ;和 Bentley，D.R.(2006) “Whole genome re-sequencing.”Curr Opin Genet Dev 16:545-52 中进行了讨论。
[0115]制备用于Illumina系统的模板的第一阶段是通过雾化使DNA片段化。然而，所产生片段的宽的尺寸分布是不经济的，因为在雾化之后，可用于后续模板制备步骤的20至200个片段占总DNA的约10%。而且，在雾化之后约一半的DNA汽化(vaporize)，意味着仅5%的原始DNA用于制备测序模板。另外，在测序反应之前，将在桥式扩增期间形成的克隆簇中50%的DNA链(例如具有游离5’端的链)除去。
[0116]在一些实施方案中，使用单分子实时测序来分析通过本文所述方法产生的多核苷酸。单分子实时测序(single molecule real-time sequencing，SMRT)是另一种大规模并行测序技术，其可用于以高通量方式对环化单链核酸进行测序。由Pacific B1sciences开发并商业化的SMRT技术依赖于多重零模式波导(ZMff)的阵列，其中例如数千个测序反应可同时发生。ZMff是产生这样的发光观察体积的结构，所述体积小到足以观察例如单链DNA分子通过单一 DNA聚合酶的模板依赖性合成(参见，例如Levene等(2003) “Zero ModeWaveguides for Single Molecule Analysis at High Concentrat1ns，，，Science 299:682-686)。当DNA聚合酶将互补的荧光标记核苷酸并入正在合成的DNA链中时，该酶将每一核苷酸在检测体积中保持数十毫秒，例如比未并入核苷酸扩散进出检测体积所用时间量长几个数量级。在此期间，荧光团发射荧光，其颜色对应于核苷酸碱基的种类。然后，作为核苷酸并入循环的一部分，聚合酶将之前使荧光团保持在适当位置的键切割，并且染料从检测体积扩散出来。在并入后，信号立即返回基线并重复该过程。ZWE及其在单分子分析(例如SMRT测序)中的应用的另外的描述可在例如公开的美国专利申请N0.2003/0044781和美国专利N0.6，917，726中找到，其各自出于所有目的通过引用以其整体并入本文。还参见 Levene 等(2003) “Zero Mode Waveguides for single Molecule Analysis at HighConcentrat1ns，，，Science 299:682-686 和 Eid，等(2009) “Real-Time DNA Sequencingfrom Single Polymerase Molecules.，，Science 323:133_138。
[0117]通过本文所述方法产生的多核苷酸可适用于SMRT测序平台。例如，在合成之后，可使用催化单链DNA片段之分子内连接的酶(例如，CircLigaseTm、CircLigaseTm II或ThermoPhageTm)使单链多核苷酸环化，并将其分配到ZMW。或者，可在环化之前使子链片段化。任选地，可在环化之前从片段化子链群富集目的序列，例如如下所述。
[0118]在分析目的多核苷酸之前，可由通过本文所述方法产生的单链多核苷酸进一步富集目的多核苷酸。富集一般包括使单链多核苷酸群与探针组相接触，其中所述探针与一个或更多个目的多核苷酸杂交，从而富集目的多核苷酸。本文所述富集方法降低了待分析多核苷酸序列的复杂性并使得目的多核苷酸更好地呈现在库中。
[0119]因此，在一些实施方案中，所述方法还包括富集步骤，所述富集步骤包括:1)使通过任意本文所述方法产生的单链多核苷酸群与探针组相接触，所述探针可与靶多核苷酸上的一个或更多个区域杂交；以及2)将与探针结合的多核苷酸与其余的多核苷酸分离，其中包含一个或更多个所期望区域的多核苷酸被富集。
[0120]本文使用的探针可与任何目的区域杂交。在一些实施方案中，一个或更多个期望区域是癌基因所在的区域。在一些实施方案中，一个或更多个期望区域是目的突变所在的区域。在一些实施方案中，一个或更多个期望区域是多态性所在的区域。
[0121]探针的数目可基于样品材料的复杂性水平和所期望待测序的序列长度来选择。本文所述方法可使用单个寡核苷酸或多个(即，至少2、至少5、至少10、至少50、至少100、至少500、至少1000、至少10，000、至少100，000或更多个寡核苷酸的混合物)不同寡核苷酸来进行。这些寡核苷酸可用于富集多核苷酸序列上的多个(即，至少2、至少5、至少10、至少50、至