4小时后的电流密度高于在37°C下温育24小时后观察到的电流密度。这些结果 与已知的低温温育对质膜中AF508-CFTR的密度的作用相吻合。为了测定校正化合物对 CFTR电流密度的作用，于37°C下把细胞与10yM的受试化合物温育24小时，并把电流密度 与27°C和37°C对照组（％活性）相比较。记录之前，用胞外记录培养液冲洗细胞3次以除 去任何残留的受试化合物。与37°C对照组相比较，用10yM的校正化合物预先温育显著增 加cAMP-和染料木素依赖的电流。 8. 增效剂化合物的鉴宙
[0228] 采用穿孔膜片记录技术也研究AF508-CFTR增效剂在稳定表达AF508-CFTR的 NIH3T3细胞中增加宏观AF508-CFTRC1流（IAF5J的能力。自光学试验鉴定的增效剂 诱发了与光学试验中观察到的类似效力和有效性的IAF5(]S的剂量依赖性增加。在检测的所 有细胞中，在使用增效剂之前和期间的反转电位为约-30mV，其为计算的Ea(-28mV)。 9溶液
[0229] 细胞内溶液（以mM表示）：Cs_ 天冬氨酸（90)、CsCl(50)、MgCl2(l)、HEPES(10)和 240yg/ml两性霉素-B(用CsOH把pH调至7. 35)。
[0230] 细胞外溶液（以mM表示）：N_ 甲基-D-葡糖胺（NMDG) -C1 (150)、MgCl2 (2)、 CaC12 (2)，和HEPES(10)(用HC1 把pH调至 7. 35)。 10.细朐培养
[0231] 稳定表达AF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞用于全细胞记录。在175cm2培 养瓶中，于5 % 0)2和90 %湿度下，在37°C下把细胞保持在用2mM谷氨酰胺、10 %小牛血清、 IXNEAA、0-ME、1X青霉素/链霉素和25mMHEPES补充的Dulbecco's改良Eagle's培养 基中。对全细胞记录，把2500-5000细胞接种到聚-L-赖氨酸涂覆的玻璃盖玻片上，在用前 于27°C下培养24-48小时以试验增效剂的活性；并且于37°C下在校正化合物存在或不存在 下温育用于测量校正剂的活性。 11. 单通道ip,录
[0232] 采用切除的内面外向式膜片观察NIH3T3细胞中稳定表达的温度校正的 AF508-CFTR的单通道活性和增效剂化合物的活性。简言之，采用Axopatch200B膜片钳放 大器（AxonInstruments公司）室温下进行单通道活性的电压钳记录。所有记录在10kHz 的采样频率和400Hz低通滤波下获得。当充满胞外溶液时，膜片钳（Patchpipettes)自 CorningKovarSealing#7052 玻璃（WorldPrecisionInstruments公司，Sarasota，FL) 制作并具有5-6MQ的电阻。通过加入ImMMg-ATP和75nM的cAMP依赖的蛋白激酶、催化 亚基（?以，？仰!^8&公司.1&1(118〇11，11)，在切除后激活八？508-0?11?。在通道活性稳定后， 采用重力驱动的微灌注术系统灌注膜片。邻近膜片放置流入物，导致1-2秒内溶液完全交 换。为在快速灌注期间维持AF508-CFTR活性，把非特异性磷酸酶抑制剂F(10mMNaF)加 入到浴液中。在这些记录条件下，通道活性在整个膜片记录期间保持恒定（最高达60分 钟）。通过自胞内溶液移动至胞外溶液的正电荷产生的电流（阴离子以相反方向移动）作 为正电流显示。钳制电压（pipettepotential) (Vp)保持在80mV。
[0233] 自包含< 2个活性通道的膜片分析通道活性。在实验过程中同时开口的最大数量 决定了活性通道的数量。为了测定单通道电流幅度，自120秒的AF508-CFTR活性记录的 数据于 100Hz被"离线（off-line)过滤"，然后采用Bio-PatchAnalysis软件（Bio-Logic Comp.法国）用于构建用多高斯函数拟合的所有点振幅直方图。自120秒的通道活性测定 总微观电流和开放概率（P〇)。采用Bio-Patch软件或自关系式Po=I/i(N)测定Po,其中 I=平均电流，i=单通道电流幅值，和N=膜片中活性通道的数量。 12. 溶液
[0234] 胞外溶液（以mM表示）：NMDG(150)、天冬氨酸（150)、CaCl2 (5)、MgCl2 ⑵和 HEPES(10)(用Tris碱把pH调至 7. 35)。
[0235] 胞内溶液（以mM表示）：NMDG-C1 (150)、MgCl2(2)、EGTA(5)、TES(10)和Tris碱 (14)(用此1把口11调至7.35)。 13. 细朐培养
[0236] 稳定表达AF508-CFTR的NIH3T3小鼠成纤维细胞用于离体膜膜片钳记录。在 175cm2培养瓶中，于5% 0)2和90%湿度下，在37°C下把细胞维持在用2mM谷氨酰胺、10% 小牛血清、IXNEAA、0 -ME、1X青霉素/链霉素和25mMHEPES补充的Dulbecco's改良的 Eagle's培养基中。对单通道记录，把2500-5000个细胞接种到聚-L-赖氨酸涂布的玻璃 盖玻片上并在用前于27°C下培养24-48小时。
[0237] 采用上述程序，通过上述技术测定出化合物1的活性，即EC5c]，并显示在表6中。 表6.
其它方面
[0238] 本发明参考的所有出版物和专利都以完全相同的程度结合到本发明中作为参考， 如同各个出版物或专利申请都特别并单独指明结合本文中作为参考一样。结合到本文中作 为参考的任何专利或出版物中的各术语的含义与本公开中所用的术语含义相冲突时，意欲 以本公开中所用的术语含义为准。此外，前述讨论公开和描述的仅为本发明的示例性实施 方案。本领域技术人员很容易从这些讨论中和从所附的图示和权利要求中识别出其中在不 背离以下权利要求书中所定义的本发明的精神和范围之下可以做出的各种变化、修饰和变 更。
【主权项】
1. 一种3-(6-(1-(2, 2-二氟苯并[d][l，3]二氧杂环戊烯-5-基）环丙烷甲酰胺 基）-3-甲基吡啶-2-基）苯甲酸（化合物1)的固体形式，其特征在于其作为化合物1的 A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐存在。2. 权利要求1的化合物1的A型溶剂化物，其中化合物1的A型溶剂化物的特征在于 化合物1的晶格，其包含很多为空的或者至少部分被溶剂化物占据的重复的空穴。3. 权利要求1的化合物1的A型溶剂化物，其中化合物1的A型溶剂化物的特征在于 化合物1的晶格，其包含很多重复的空穴，其中多数空穴是空的。4. 权利要求1、2或3的化合物1的A型溶剂化物，其特征在于在采用Cu-Ka辐射获得 的X-射线粉末衍射图中，在21. 5-21. 9度、8. 8-9. 2度和10. 8-11. 2度处的一或多个峰。5. 权利要求1、2或3的化合物1的A型溶剂化物，其特征在于在采用Cu-Ka辐射获 得的X-射线粉末衍射图中，在21. 5-21. 9度、8. 8-9. 2度、10. 8-11. 2度、18. 0-18. 4度和 22. 9-23. 3度处的一或多个峰。6. 权利要求1、2或3的化合物1的A型溶剂化物，其特征在于在21. 70、8. 98、11. 04、 18. 16和23. 06度处的一或多个峰。7. 权利要求1、2或3的化合物1的A型溶剂化物，其特征在于在21. 5-21. 9度处的一 个峰。8. 权利要求1、2或3的化合物1的A型溶剂化物，其特征在于在21. 70度处的一个峰。9. 权利要求6-8中任一项的化合物1的A型溶剂化物，其特征还在于在8. 8-9. 2度处 的一个峰。10. 权利要求6-9中任一项的化合物1的A型溶剂化物，其特征还在于在8. 98度处的 一个峰。11. 权利要求6-10中任一项的化合物1的A型溶剂化物，其特征还在于在10. 8-11. 2 度处的一个峰。12. 权利要求6-11中任一项的化合物1的A型溶剂化物，其特征还在于在11. 04度处 的一个峰。13. 权利要求6-12中任一项的化合物1的A型溶剂化物，其特征还在于在18. 0-18. 4 度处的一个峰。14. 权利要求6-13中任一项的化合物1的A型溶剂化物，其特征还在于在18. 16度处 的一个峰。15. 权利要求6-14中任一项的化合物1的A型溶剂化物，其特征还在于在22. 9-23. 3 度处的一个峰。16. 权利要求6-15中任一项的化合物1的A型溶剂化物，其特征还在于在23. 06度处 的一个峰。17. 权利要求2的化合物1的A型溶剂化物，其中所述化合物1的A型溶剂化物特征在 于其衍射图与图1的衍射图基本类似。18. 权利要求2的化合物1的A型溶剂化物，其中所述溶剂化物选自其体积足以适于所 述多个的重复空穴的有机溶剂化物。19. 权利要求18的化合物1的A型溶剂化物，其中所述溶剂化物选自甲醇、乙醇、丙酮、 异丙醇、乙腈、四氢呋喃、乙酸甲酯、2- 丁酮、甲酸乙酯、乙酸乙酯和2-甲基四氢呋喃。20. 权利要求18的化合物1的A型溶剂化物，其中所述化合物1的A型溶剂化物包含 根据TGA测定的1 -10 wt. %溶剂化物。21. 权利要求20的化合物1的A型溶剂化物，其中所述化合物1的A型溶剂化物包含 根据TGA测定的2 -5 wt. %溶剂化物。22. 权利要求2的化合物1的A型溶剂化物，其中熔点为185°C _190°C。23. 权利要求2的化合物1的A型溶剂化物，其具有P2 i/n空间群和下列晶胞大小： a = 16.5235 (10) A a = 90。 b = 12. 7425 (8) A 0 = 103. 736 (4) ° c = 20.5512 (13) A y = 90。。24. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于在采用Cu-Ka辐射获得的X-射 线粉末衍射图中，在8. 8-9. 2度、17. 3-17. 7度和18. 2-18. 6度处的一或多个峰。25. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于在采用Cu-Ka辐射获得的X-射 线粉末衍射图中，在 8. 8-9. 2 度、17. 3-17. 7 度、18. 2-18. 6 度、10. 1-10. 5 度和 15. 8-16. 2 度 处的一或多个峰。26. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于在8. 96、17. 51和18. 45度处的 一或多个峰。27. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于在8. 96、17. 51、18. 45、10. 33和 16. 01度处的一或多个峰。28. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于在8. 8-9. 2度处的一个峰。29. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于在8. 96度处的一个峰。30. 权利要求28或29的化合物1的A型HCl盐，其特征还在于在18. 2-18. 6度处的一 个峰。31. 权利要求28-30中任一项的化合物1的A型HCl盐，其特征还在于在18. 45度处的 一个峰。32. 权利要求28-31中任一项的化合物1的A型HCl盐，其特征还在于在10. 1-10. 5度 处的一个峰。33. 权利要求28-32中任一项的化合物1的A型HCl盐，其特征还在于在10. 3度处的 一个峰。34. 权利要求28-33中任一项的化合物1的A型HCl盐，其特征还在于在15. 8-16. 2度 处的一个峰。35. 权利要求28-34中任一项的化合物1的A型HCl盐，其特征还在于在16. 01度处的 一个峰。36. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于其衍射图与图21的衍射图基本 类似。37. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于图19中所示的二聚体。38. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其特征在于图20中所示的堆积图。39. 权利要求1的化合物1的A型HCl盐，其具有P 1空间群和下列晶胞大小：a = 10.2702 (2) A，b = 10.8782 (2) A，c = 12.4821 (3) A，a = 67.0270 (10)。，P = 66.1810 (10)。和 y = 72.4760 (10)。。40. 权利要求1的化合物1的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐，其中化合物I 的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐具有0. 1微米-50微米的粒度。41. 权利要求1的化合物1的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐，其中化合物1 的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐具有0. 1微米-20微米的粒度。42. 权利要求1的化合物1的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐，其中化合物1 的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐具有0. 1微米-10微米的粒度。43. 权利要求1的化合物1的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐，其中化合物1 的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐具有I. 0微米-5微米的粒度。44. 权利要求1的化合物1的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐，其中化合物1 的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐具有2. 0微米的粒度D50。45. -种药用组合物，其包含权利要求1的化合物1的A型溶剂化物或者化合物1的A 型HCl盐和药学上可接受的载体。46. 权利要求40的药用组合物，其还包含另外的治疗剂。47. -种在哺乳动物中治疗CFTR介导的疾病的方法，其包括给予所述哺乳动物有效量 的权利要求1的化合物1的A型溶剂化物或者化合物1的A型HCl盐。48. 权利要求的47方法，其中所述CFTR介导的疾病选自：囊性纤维化、哮喘、吸烟诱发 的COPD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰功能不全、先天性双侧缺乏输精管引起的 男性不育症（CBAVD)、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲霉病（ABPA)、肝疾病、遗 传性肺气肿、遗传性血色沉着病、凝血纤维蛋白溶解缺陷、C蛋白缺乏症、1型遗传性血管性 水肿、脂质处理缺陷症、家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无P脂蛋白血症、溶酶体 贮积病、I-细胞病/假性赫尔勒病、粘多糖贮积症、Sandhof?病/黑蒙性痴呆、克里格勒-纳 贾尔II型综合征、多发性内分泌病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化酶缺乏 症、原发性甲状旁腺功能减退、黑素瘤、1型糖酵解CDG、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全 症、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺乏症、尿崩症（DI)、神经性DI、肾性DI、夏-马-图三氏 综合征、佩-梅氏病、神经变性疾病、阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化 症、进行性核上性麻痹、皮克氏病、几种多聚谷氨酰胺神经障碍、亨廷顿氏病、I型脊髓小脑 性共济失调、脊髓和延髓肌肉萎缩、齿状核红核苍白球路易斯体萎缩、强直性肌营养不良、 海绵状脑病、由于朊蛋白加工缺陷引起的遗传性克雅氏病、法布里病、斯脱斯勒-史茵克综 合征、COPD、干眼病、斯耶格伦氏病、骨质疏松症、骨质减少、戈汉综合征、氯离子通道病、先 天性肌强直症（汤姆孙和贝克尔型）、III型巴特氏综合征、Dent氏病、惊跳症、癫痫、惊跳 症、溶酶体贮积病、Angelman综合征、原发性纤毛运动障碍（PCD)、纤毛结构和/或功能遗传 性疾病、伴随内脏逆位的PCD、不伴随内脏逆位的PCD或纤毛发育不全。49. 权利要求48的方法，其中所述CFTR介导的疾病是囊性纤维化、肺气肿、C0PD、干眼 病或骨质疏松症。50. 权利要求48的方法，其中所述CFTR介导的疾病是囊性纤维化。51. 权利要求48-50中任一项的方法，其中所述患者具有带有A F508突变的囊性纤维 化跨膜受体（CFTR)。52. 权利要求48-50中任一项的方法，其中所述患者具有带有Rl 17H突变的囊性纤维化 跨膜受体（CFTR)。53. 权利要求48-50中任一项的方法，其中所述患者具有带有G551D突变的囊性纤维化 跨膜受体（CFTR)。54. 权利要求48-50中任一项的方法，其中该方法包括给予另外的治疗剂。55. -种药剂盒，其包含权利要求1的化合物1的A型溶剂化物或者化合物1的A型 HCl盐和其使用说明书。
【专利摘要】本发明涉及一种基本为固体形式的3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)环丙烷甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸(化合物1，A型溶剂化物和化合物1，A型HCl盐)、制备这些形式的方法、其药用组合物和采用其的治疗方法。
【IPC分类】A61P1/10, A61P11/00, A61P25/00, A61P15/08, A61P25/14, A61P1/16, A61P29/00, A61P25/08, A61P13/12, A61P5/48, A61P35/00, A61P3/12, A61P25/28, A61P25/16, A61P3/10, A61P19/10, A61P11/02, A61P1/18, A61P5/14, C07D405/12, A61K31/443, A61P11/06, A61P19/00, A61P13/00, A61P21/00, A61P25/18, A61P7/00, A61P3/06, A61P27/04
【公开号】CN105037334
【申请号】CN201510463244
【发明人】A.克沙瓦什霍克里, B.张, M.克拉维奇
【申请人】弗特克斯药品有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2011年4月7日
【公告号】CA2795748A1, CN102933206A, EP2555754A2, US8507687, US8742122, US8969574, US20110263654, US20130085158, US20130296379, US20140221430, US20150196539, WO2011127290A2, WO2011127290A3