一类丙烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是涉及非病毒基因载体及制备方法。 技术背景
[0002] 基因治疗是通过向靶细胞或组织引入外源基因DNA或RNA片段，来纠正或补偿基 因的缺陷，关闭或抑制异常基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为一种新 的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免 疫性疾病，其中癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。在基因治疗发展的几十年里， 全世界启动了近2000例基因转染的基因治疗临床试验。1990年美国国立卫生研究院的 Culver等首次将基因治疗应用到临床试验，采用基因治疗方法对腺苷脱氨酶（ADA)缺陷症 进行治疗并取得了成功。2000年，法国成功采用基因治疗技术治愈联合免疫缺陷综合症 (X-SCID)，从此证实了基因治疗策略的有效性。但是基因治疗要得到进一步的发展，必须克 服三个方面的难题：一、要有用于治疗的目的基因和接受目的基因的细胞；二、实现基因表 达的可调控性；三、获得具有靶向性的高效低毒的基因载体系统。其中，具有靶向性高效的 基因载体系统，成为制约基因治疗发展的瓶颈之一。
[0003]阳离子脂质体具有类细胞结构和生物膜的特性，在体内可降解，可以保护其运载 基因片段的生物活性，是一种有临床应用潜力的非病毒基因转染载体。脂质体的这种结 构可以包裹药物粉末或压缩基因形成复合物，递送至病变组织或细胞，进入人体内主要被 网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主 要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂 量和降低药物的毒性。自从1987年Feigner等首次利用N-[l-(2, 3-二油酰氧基）丙 基]-N，N，N-三甲基氯化铵（D0TMA)对C0S-7等细胞进行成功转染后，脂质体已经发展成为 除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法，特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗 中应用较多。但由于其仍存在一定的局限性，如细胞毒性大，对器官的靶向性不明显，基因 转运机制不明确等限制了其广泛应用。因此，人们一直致力于对阳离子脂质体的各种构建 及化学修饰，试图寻求一种高效低毒的基因治疗载体。
[0004] 脂质体发展的近30年来，从广泛使用的季铵盐头部、胍基头部到多胺头部阳离子 脂质，已经形成了比较完善的脂质体载体系统，但这些载体系统仍然存在许多问题，如介导 基因的转运效率还有待提高；对靶组织无定向识别性；阳离子脂质体/DNA复合物进入细胞 后，核酸被束缚于内涵体中，释放困难，不利于在细胞质或细胞核中表达，从而无法达到治 疗目的。中国专利CN103553970A，2014-02-05公开了一类氨基甲酸酯型阳离子脂质的制备 及其在药物或基因转运中的应用，该载体虽具有高效的基因转运能力，但由于具有季铵盐 头部结构而存在一定的细胞毒性，因此在体内基因转运方面受到了限制。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一类细胞毒性小，在体外基因转染效率高的丙烷基阳离子 肽脂质及其合成方法和应用。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0007] -、一类丙烷基阳离子肽脂质及制备方法
[0008] 1、一类丙烷基阳离子肽脂质，其化学结构由通式I表示：
[0009]
[0010] 其中：
[0011] 札选自C12。烷基，最优选C12、C14、Clf^Cls;
[0012] x选自1~6，最优选2~4 ;
[0013] AA选自Lys、Orn、Arg、His、Asp、Ala或Gly。
[0014] 2、一类丙烷基阳离子肽脂质的合成方法，它是以氨基保护的氨基酸制备肽头部中 间体；将已氨基保护的3-氨基-1，2-丙二醇用酰化试剂酰化后与烷基胺反应，制备双长碳 链中间体；将制备的肽头部中间体与制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接；将保护 基团脱掉，再与氨基保护的氨基酸进行反应，脱保护后得到所述丙烷基阳离子肽脂质化合 物。
[0015] 具体步骤如下：
[0016] (1)利用正交保护法，采用保护试剂保护氨基酸的氨基，制备氨基酸头部中间体： 所述氨基酸为赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸或精氨酸。所述保护试剂为Boc20、Fmoc-0Su或CbzCl 等，所述保护试剂与氨基酸摩尔比为1:1~8:1，反应溶剂为乙腈、水、四氢呋喃、甲苯、丙酮 或上述溶剂的混合物等，反应时间为1~20h，反应温度为0~100°C。反应后旋蒸掉溶剂， 进行重结晶提纯，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂（v/V= 3:1)。
[0017] (2)用Fmoc-OSu保护试剂保护3-氨基-1，2-丙二醇的氨基，并与酰化试剂酰化 后，与烷基胺反应，制备双取代的丙烷基长碳链中间体化合物：所述酰化试剂为羰基二咪 唑，所述酰化试剂与3-氨基-1，2-丙二醇的摩尔比为1:1~3:1，酰化后3-氨基-1，2-丙 二醇与烷基胺的摩尔比为1:1~8:1，反应溶剂为30mL~300mL甲苯、二氯甲烷、DMF或氯 仿，反应时间为12~48h，反应温度为25~100°C。反应后，在70°C下旋转蒸发掉溶剂，用 DMF、乙酸乙酯、乙醇、水或乙醇/水的混合溶剂进行重结晶。
[0018] (3)将步骤（1)制备的肽头部中间体，与步骤（2)制备的双长碳链中间体经过酰 胺化进行连接首先将肽头部中间体进行活化，所述的活化试剂为2-(7-偶氮苯并三氮 唑）-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)、N，N' -二环己基碳酰亚胺（DCC)或1-羟基 苯并三唑（HOBt)，肽头部中间体与活化试剂摩尔比为1:1~1:8,反应温度为0~60°C，反 应时间为〇. 5~24h。b在步骤a反应液中加入双长碳链中间体的二氯甲烷、DMF或三氯甲 烷溶液，经过酰胺化使中间体的氨基与肽头部中间体的羧基生成酰胺键，肽头部中间体与 长碳链中间体两者摩尔比为1:1~8:1反应，反应溶剂为甲苯、DMF、氯仿、丙酮或二氯甲烷， 反应时间为12~96h，反应温度为20~100°C。
[0019] (4)将保护基团脱掉，所述氨基脱保护试剂为10%NaHC03(w/v)或三氟乙酸，脱保 护试剂与类脂化合物摩尔比为1:1~1:2,脱保护时间l-8h，脱保护温度为0~4°C;产物 进行重结晶提纯得到粗产物，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯、乙腈、乙醇、水或无水乙醚。
[0020] (5)重结晶后使用柱层析法进行纯化，粗产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗 产物，用甲醇/氯仿（3:1体积比）混合试剂进行洗脱。用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得 到含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质化合物。
[0021] (6)以含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质化合物为原料，合成其他丙烷基阳离 子肽脂质：将步骤（1)制备的肽头部中间体与步骤（5)制备的含有一个氨基酸头部的阳离 子肽脂质，经过氨基酸活化和酰胺化，得到头部为1~4个氨基酸的阳离子脂质化合物。两 者摩尔比为1:8~8:1，具体反应条件与提纯方法与步骤（3) (4) (5)相同。
[0022] 二、阳离子肽脂质体及制备方法
[0023] 1、一种由所述丙烷基阳离子肽脂质制备的阳离子肽脂质体，该阳离子肽脂质体为 丙烷基阳离子肽脂质分散在水相中形成的粒径大小为l〇〇nm左右的均一稳定的表面带有 正电荷的脂质体。
[0024] 2、丙烷基阳离子肽脂质体的制备方法，步骤如下：按摩尔比1:1~8:1将所述丙烷 基肽脂质化合物和助剂在氯仿、甲醇等有机溶剂中混合，使丙烷基肽脂质化合物的浓度为 l-8mg/mL。在氮气下将溶液吹干，形成均匀薄膜，真空干燥2~24h(真空度为0. 09MPa，常 温）。加入超纯水、乙醇或磷酸缓冲液，在10~80°C水化1~10h，超声频率为100Hz下超 声震荡至澄清透明，所述阳离子肽脂质体浓度为〇. 5~3mg/mL。所述助剂为卵磷脂、蔗糖 酯、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱（D0PC)或胆固醇。
[0025] 三、丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物及制备方法
[0026] 1、丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物是由所述丙烷基阳离子肽脂质体与pDNA 或siRNA通过静电相互作用形成分散在水相中均一稳定的纳米颗粒。
[0027] 2、丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物的制备方法，步骤如下：
[0028] (1)取所述丙烷基阳离子肽脂质体分散在细胞培养液（DMEM或RPMI1640)中，混 匀，使浓度为 〇? 02yg/yL~0? 16yg/yL;
[0029] (2)将0? 5~1. 0ygpDNA或siRNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀 使质粒浓度为〇? 02yg/yL;
[0030] ⑶按照脂质体与基因质量比1:1~8:1比例，将⑴和⑵两稀释液混勾，室温 放置10~40min，即可得到丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物。
[0031] 四、所述丙烷基阳离子肽脂质体/基因复合物在细胞转染中的应用，主要包括：
[0032] (1)所述丙烷基肽脂质体/基因复合物可进入癌细胞中，完成目的基因在细胞内 的转染。
[0033] (2)所述细胞为人喉癌上皮细胞Ofep-2)和非小肺腺癌细胞（A549)。不同氮磷比 下获得的所述肽脂质体/基因复合物在不同细胞内的转染效率会有所差异。
[0034] (3)本发明提供的丙烷基肽脂质体/基因复合物适用于包括编码荧光素酶、绿色 荧光蛋白等报告基因在内的PDNA，也适用于其他各种实验所需的siRNA。该载体能高效运 载质粒DNA和siRNA转染细胞。
[0035] 本发明的作用机理大致如下：本发明提供的一类丙烷基肽脂质，同时具有疏水和 亲水特性，其疏水部分来源于丙烷基双长碳链，亲水部分取自于具有良好生物相容性的