优化的Fc片段及其优化方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及优化的Fe片段及其优化方法和应用。
【背景技术】
[0002]抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗如ELISA、Western blot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。因此，进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性抗体药物的研发与临床应用，这是因为它对人体毒副作用小、具有天然和高度特异性的疗效，并且创造出了巨大的社会效益和经济效益。
[0003]同时，基于Fe片段的融合蛋白不仅以其分子量相对较小而具有很好的组织渗透性，而且偶联的Fe片段可与Fe受体(FcRn)等效应分子相互作用，因而延长了药物的血浆半衰期以及可诱导ADCC、⑶C效应或者吞噬作用。
[0004]然而，这些抗体药物以及Fe融合蛋白作为生物活性大分子，它也有自身的局限性，如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体热稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供优化的Fe片段及其优化方法和应用。解决了现有Fe片段的热稳定性和抗聚集能力差的技术问题。
[0006]为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0007]优化的Fe片段，是通过将Fe片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除得到的。
[0008]本发明中涉及的Fe片段可以采用不同物种的免疫球蛋白的Fe片段，具体地，如哺乳动物等，更具体地，如人类。
[0009]优化方法，包括利用RT-PCR，从血样中扩增出野生型Fe，再设计引物将野生型Fe的N端的7个氨基酸进行截断，扩增出优化Fe片段的扩增步骤。
[0010]进一步地，所述扩增步骤中，以人源血样为例，野生型Fe的扩增方法为:人源血样抽提细胞总RNA，逆转录得到cDNA ;以cDNA为模板进行PCR反应，得到野生型Fe基因片段；PCR 反应中采用的正向引物为 5-TCG CTA CCG TGG TGGCC CAGGC GGCC GCA CCT GAA CTCCTG GGG GGA C-3，反向引物为 5-GTG GTGGTG GTGGCC GGCCT GGCC TTT ACC CGG AGA CAGGGA GAG GCT C-3。
[0011]进一步地，所述扩增步骤中，以人源血样为例，优化的Fe片段的扩增方法为:以野生型Fe基因片段为模板进行PCR反应，得到优化的Fe片段；其中，PCR反应中采用的正向引物为 5-TCG CTA CCG TGG TGGCC CAGGC GGCC CCG TCA GTC TTC CTC TTC C-3，反向引物为 5-GTG GTGGTG GTGGCC GGCCT GGCC TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT C-3。
[0012]进一步优选的技术方案为，在扩增步骤完成后，还包括表达与纯化步骤；所述表达与纯化步骤具体为:将Sfi I酶切后的优化Fe片段与原核表达载体进行连接、转化相应的表达宿主菌得到优化Fe菌株；再对优化Fe菌株进行原核表达，纯化得到优化Fe片段的目的蛋白。
[0013]具体地，所述原核表达载体采用表达载体pCom，相应的表达宿主菌采用大肠杆菌HB2151。或者其它原核表达载体和相应的表达宿主菌。
[0014]进一步地，在表达与纯化步骤中，首先采用琼脂糖凝胶电泳回收优化Fe片段，然后用Sfi I酶切优化Fe片段，再胶回收，得到Sfi I酶切后的优化Fe片段。
[0015]进一步地，在表达与纯化步骤中，原核表达具体操作如下:将优化Fe菌株接种到1ml SB培养基，于37°C、250rpm摇床培养3?4小时；随后，按2%接种量接种到500mlSB培养基，于37°C、250rpm摇床培养至0D600达到0.6时，加入250 μ I浓度为200 μ g/mlIPTG于37 °C诱导表达过夜。
[0016]具体地，所述SB培养基的组成为:1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和1g MOPS, pH 值用 5M NaOH 调至 7.0。
[0017]进一步地，在表达与纯化步骤中，纯化具体操作如下:经原核表达后，第一次离心收集菌体，用50ml PBS重悬，加入250 μ I多粘菌素B室温处理30min，再次离心收集上清；将收集的上清过滤后，用N1-NTA填料纯化优化的Fe蛋白；将镍柱洗脱后的优化的Fe蛋白稀释到50ml，进一步用Protein G填料分别纯化优化的Fe蛋白，随后用截留分子量为1kD的超滤离心管超滤浓缩优化的Fe目的蛋白；其中，第一次离心的参数为:8000g，4°C，15min ;再次离心的参数为:10000g，4°C，15min。
[0018]本发明的优化的Fe用于含有Fe片段的改造的应用。
[0019]进一步地，本发明的优化的Fe用于全长单克隆抗体、抗体片段与Fe的融合蛋白、生物活性蛋白与Fe的融合蛋白、生物活性化合物与Fe的偶联产物等的含有Fe片段的改造的应用。
[0020]本发明以Fe为骨架，对其进行定向修饰改造，最终得到稳定性与抗聚集性得到提高的新的Fe克隆。本发明提供的优化的Fe片段骨架可应用于完整的IgG或者相关的Fe融合蛋白以及用于进一步研究给相关生物制剂的血浆半衰期的带来的影响。
[0021]本发明通过⑶、分子筛、荧光检测仪、紫外分光光度计、ELISA等方法对优化的Fe片段的二级结构、存在形式、稳定性、抗聚集性进行了鉴定，用野生型Fe进行对照。ELISA实验也证明Fcs能够与Fe受体(FcRn)相结合，因此，修饰改造后的Fcs提高了自身稳定性的同时并没有破坏自身生物学效应。
[0022]本发明提供的Fcs骨架，其优点在于:首先，相对于野生型的Fe，其稳定性更好，可降低单克隆抗体或者Fe融合蛋白的生产、纯化、保存成本；其次，相对于野生型的Fcs，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。
[0023]本发明中，制备优化Fe的方法不仅限于对Seq ID N0.3序列中的Fe的改造，也包括对其它各类抗体分子的Fe片段的改造，比如，对不同类型的免疫球蛋白，来源于不同物种的免疫球蛋白的改造。
【附图说明】
[0024]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1是现有Fe片段的结构示意图；
[0026]图2是本发明的优化方法中Fe、Fcs蛋白的蛋白免疫印迹检测结果图；
[0027]图3是本发明的优化方法中纯化后的Fe、Fcs蛋白的SDS-PAGE检测结果图；
[0028]图4是本发明的Fcs和Fe的AKTA分析结果曲线图；
[0029]图5是本发明的Fcs和Fe的圆二色⑶光谱法检测蛋白分子构象的曲线图；
[0030]图6是本发明的Fcs和Fe蛋白的圆二色⑶光谱法检测热稳定性的曲线图；
[0031]图7是本发明的Fcs和Fe蛋白的变性剂条件下稳定性分析拟合曲线图；
[0032]图8为本发明的Fe、Fcs蛋白的抗聚集性的0D320nm经时曲线图；
[0033]图9为本发明的Fe、Fcs蛋白与FcRn在不同pH值下结合的0D405在不同浓度下的拟合曲线图。
【具体实施方式】
[0034]下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]实施例1
[0036]本发明的优化的Fe片段，是以Fe基因片段为骨架，对其进行修饰，将Fe片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除后，最终得到稳定性与抗聚集性得到提高的优化的Fe克隆，命名为Fcs。下面以“Fcs”代表本发明的优化的Fe片段。其中，Fe基因片段可以是不同物种的免疫球蛋白中Fe片段。
[0037]下面以人类的免疫球蛋白的Fe片段为改造对象，说明本发明的优化的Fe片段的优化方法，包括以下步骤:
[0038]为了方便将本发明的Fcs(优化的Fe片段)与Fe的各项性能进行比对，在本实施例I的优化方法中同时记载了 Fe的扩增及表达纯化的步骤。
[0039]步骤一、扩增Fe、Fcs基因片段
[0040]采取人源血样，用Trizol Reagent (Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，得到的细胞总RNA溶解于50 μ L无RNA酶的水中。然后用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)，采用随机引物，逆转录得到cDNA。
[0041]根据IgGl的Fe的基因序列(GenBank:KJ905798.1)，分析其氨基酸序列，设计Fe、Fcs基因的正、反向引物扩增目的片段:正向引物1:5-TCG CTA CCG TGG TGGCC CAGGC GGCCGCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA C-3,正向引物 2:5_TCG CTA CCG TGG TGGCC CAGGC GGCCCCG TCA GTC TTC CTC TTC C-3 (横线标注为 Sf i I 酶切位点)；反向引物:5_GTG GTGGTGGTGGCC GGCCT GGCC TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT C-3 (横线标注为 Sfi I 酶切位点)。
[0042]先用正向引物I与反向引物以cDNA为模板进行PCR反应，得到Fe基因片段(核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示)；再用正向引物2与反向引物以Fe基因片段为模板进行PCR反应，从而得到含有Fcs基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)。
[0043]琼脂糖凝胶电泳回收Fe、Fcs基因片段。
[0044]步骤二、表达并纯化Fe、Fcs
[0045]用Sfi I酶切Fe、Fcs基因和载体pCom(Addgene)，胶回收，将Sfi I酶切后的Fe基因、Fcs基因分别与载体pCom连接、转化E.coli HB2151感受态，随后挑取单克隆送测序。根据测序结果，挑取序列正确的单克隆用于后续实验。其中，原核表达载体不限于上述的载体pCom，还可以采用其它原核表达载体和相应的表达宿主菌。
[0046]将上述得到的Fe、Fcs菌株分别接种到1ml SB培养基(1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和1g MOPS, pH值用5M NaOH调至7.0)，于37°C、250rpm摇床培养3?4小时。随后，按2%接种量分别接种到500ml SB培养基，于37°C、250rpm摇床培养至