交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品化学技术领域，尤其涉及一种交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 固定化脂肪酶是将脂肪酶通过物理或化学的方法与某种物体结合制备成为不溶 于水的，但仍具有催化活性的复合体，这一过程是将单体的游离脂肪酶转变成了被某种物 体束缚的复合脂肪酶催化剂。
[0003] 脂肪酶（EC3. 1. 1. 3)在自然界中广泛存在，工业领域的脂肪酶主要运用于化工、医 药、食品等，来源于微生物中。在酶催化反应中，脂肪酶在油水界面具有"界面活性"的特点， 共同的催化活性中心 -即Ser、Asp (Glu)和His构成的三联体，包埋于一个或数个带色氨 酸(两亲性）的a-螺旋结构的"盖子"保护之下，色氨酸疏水面与催化中心疏水结构相结 合，亲水部分则暴露于外，当与界面接触时，"盖子"被打开，活性中心暴露，底物得以靠近， 同时，酶分子仍然存在一定数量的水，保证其在油水界面的自体激活。因此，两亲性物质如 磷脂、或胆酸盐等的存在对加速脂肪酶的界面活化具有重要作用。
[0004] 脂肪酶的固定化方法大致分为物理法和化学法：物理法包括吸附法和包埋法；化 学法包括交联法和共价结合法。交联法是利用交联剂对晶体酶或溶解酶交联后就形成能保 持一定催化活性的交联酶。
[0005] 中国发明专利CN102286452B公开了一种采用油酸包裹的Fe30 4纳米结构，通过与 烯酸酯的聚合，然后与水合肼、亚硝酸依次反应得到活化的叠氮磁性纳米结构的固定化酶 载体。由于固定化酶载体是在油酸包裹粒子在烯酸脂中进行共聚反应而进行的包埋，具备 的孔隙，使得叠氮化反应中的NaN0 2、引发剂过硫酸钾等能够对以Fe304为核的油酸包裹粒 子造成破坏，导致功能的缺陷。
[0006] 中国发明专利CN103012673B提供了一种生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物 微球的制备方法，用具备较强轻水性的SiOJ# Fe 304纳米粒子进行完全包裹，再将表面引入 环氧基团的聚合物，此类固定化酶虽然能够较好的保留酶活，装载量有一定的优势，然而仅 仅能运用于水溶性生物化酶的固定，无法适应脂肪酶界面活化特性。
【发明内容】
[0007] 由于脂肪酶的特殊结构和固定化基团的特殊属性，固定化的脂肪酶通常刚性结构 增加，通常在一些疏水性载体上表现出更好的活性。本发明目的在于克服现有技术存在的 缺陷，提供一种交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法，该超顺磁载体是基于脂肪酶界 面活性作用方式的超顺磁聚合微球，通过该微球对脂肪酶进行固定，固定化的脂肪酶具备 良好的磁分离性能，保留90%以上的酶活性，克服酶促反应中脂肪酶活依赖界面效应的劣 势。
[0008] 本发明通过以下技术方案来实现：一种交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方 法，经过下列各步骤： (1) 纳米磁性微球Fe304的制备： 将FeCl3 ? 6H20溶解于无水乙二醇中，配置成浓度为0. 1~0. 15mmol/mL的溶液，再按 FeCl3 ? 6H20与处理剂的质量比为1: (4~6)加入处理剂，其中处理剂为乙酸钠和聚乙二 醇，加入处理剂后使乙酸钠的浓度为80~120mg/mL，然后在200°C下恒温超声反应4~6h， 待自然冷却后，用乙醇和去离子水洗涤数次，再经真空干燥即得纳米磁性微球Fe 304; (2) 纳米磁性微球Fe304的包裹： 将步骤（1)所得纳米磁性微球Fe304与浓度为lmol/L的NaOH溶液混合，直至得到纳米 磁性微球Fe304的浓度为4~8mg/mL的悬浮液，将悬浮液经超声波分散均匀，然后加入3倍 悬浮液体积的无水乙醇、加入纳米磁性微球Fe 304质量1/5~1/10的包埋剂以及加入悬浮 液体积1/2的氨水，再在100°C下搅拌反应40min得到磁流体，然后将磁流体在1~2T的磁 场条件下静置完成磁分离，再对磁流体进行固液分离，所得固体用乙醇和去离子水洗涤数 次，即得包裹后的纳米磁性微球Fe 304; (3) 纳米微球的功能化修饰： 按（0. 2~0. 8) :200的固液比g/mL计，将步骤（2)所得包裹后的纳米磁性微球Fe304 超声分散于甲醇中，再按包裹后的纳米磁性微球Fe304与N-异丙基丙烯酰胺的质量比为 (0. 2~0. 8):4. 05加入N-异丙基丙烯酰胺，按包裹后的纳米磁性微球Fe304与偶氮二异丁 腈的质量比为（〇. 2~0. 8) :0. 15加入偶氮二异丁腈，得到反应体系，然后将反应体系置于 氮气保护下以70°C反应12h，后将反应物置于沉淀剂中进行反复沉淀，直到无沉淀析出；将 所得沉淀物进行真空干燥，即得到交联固定脂肪酶的超顺磁载体。所得交联固定脂肪酶的 超顺磁载体为淡黄色或白色的固体粉末，其粒径为300~400nm。
[0009] 所述步骤（1)或（2)中的乙醇和去离子水洗涤数次是指先用乙醇和去离子水交替 洗涤数次后，再用去离子水洗涤。
[0010] 所述步骤（2)的包埋剂为正硅酸乙酯或海藻酸钾。
[0011] 所述步骤（3)的沉淀剂为乙醚或正己烷。
[0012] 所述无水乙二醇、乙酸钠、聚乙二醇、甲醇、N-异丙基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈、正 硅酸乙酯、海藻酸钾、乙醚和正己烷均为市购分析纯。
[0013] 本发明所得超顺磁载体在使用时，按常规方法固定脂肪酶，即先分散在浓度为 0. 9wt%的氯化钠溶液或浓度为15~20wt%的乙醇溶液中，再在60°C条件下，加入戊二醛和 脂肪酶进行搅拌，并经磁分离后对固体洗涤，最后经冷冻干燥，即得到固定后的脂肪酶。
[0014] 本发明是使用海藻酸钾或正硅酸乙酯对纳米磁性微球Fe304进行包裹，将其 分散于溶液中形成磁流体，在磁流体中通过聚合合成并修饰温感聚N-异丙基丙烯酰胺 (PNIPAAm)(经步骤3的修饰，N-异丙基丙烯酰胺会形成聚N-异丙基丙烯酰胺)，加入交 联剂偶氮二异丁腈生成易于固定脂肪酶的超顺磁载体。纳米磁性微球Fe 304是一种通过溶 剂沉淀等方法较易制得的粒径在1~25nm之间的超顺磁特性的粒子，在固定化酶方面，具 有较大的比表面积、生物相容性、易回收等特点，因原子都分布于粒子表面，易引入氨基、羟 基、巯基等活性基团，从而实现通过分子间作用力或共价方式对脂肪酶(蛋白质）的交联而 固定。聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm)是一类智能温感高分子材料，由于其测量上同时具 备亲水性的酰胺基基团（-C0NH-)和疏水的异丙基基团[_CH(CH 3)2]，亲水的酰胺基团能够 与周围的水分子形成氢键，并与结构内部的疏水作用力形成相对平衡。在低于临界溶解温 度（LCST，32°C )时，氢键暴露呈现溶解性，当温度高于LCST时，氢键被破坏，聚N-异丙基丙 烯酰胺（PNIPAAm)分子内作用力增强，形成不溶性的束胶。聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm) 这种依赖温度的结构特性，为构建的界面特征，从而实现控制酶活提供了可能。
[0015] 本发明具备的优点及效果：通过本发明方法制备的超顺磁载体，引入温敏材料聚 N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm) (LCST，34°C )，能够通过控制温度改变载体的结构特性，从而 使得通过该载体固定后的脂肪酶能够摆脱界面特性的控制，直接在醇、酸和酯类之间反应， 有利于反应产物的分离；通过引入温敏材料后的纳米粒子，LCST在34°C，低于一般脂肪酶 最佳活性温度（50°C)，有利于通过a盖控制酶活性，通过控制温度高于LCST，形成虚拟的 界面性质，打开a盖，激活脂肪酶。该超顺磁载体是基于脂肪酶界面活性作用方式的超顺 磁聚合微球，通过该微球对脂肪酶进行固定，固定化的脂肪酶具备良好的磁分离性能，保留 90%以上的酶活性，克服酶促反应中脂肪酶活依赖界面效应的劣势。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明： 实施例1 (1) 纳米磁性微球Fe304的制备： 将FeCl3 ? 6H20溶解于无水乙二醇中，配置成浓度为0. 13mmol/mL的溶液，再按 FeCl3 ? 6H20与处理剂的质量比为1:6加入处理剂，其中处理剂为乙酸钠和聚乙二醇，加入 处理剂后使乙酸钠的浓度为95mg/mL，然后转移至涂有惰性材料聚四氟乙烯的反应器中，在 200°C下恒温超声反应5h，待自然冷却后，先用乙醇和去离子水交替洗涤数次后，再用去离 子水洗涤，再经真空干燥即得纳米磁性微球Fe 304; (2) 纳米磁性微球Fe304的包裹： 将步骤（1)所得纳米磁性微球Fe304与浓度为lmol/L的NaOH溶液混合，直至得到纳米 磁性微球Fe304的浓度为8mg/mL的悬浮液，将悬浮液经超声波分散均匀，然后加入3倍悬浮 液体积的无水乙醇、加入纳米磁性微球Fe 304质量1/5的海藻酸钾以及加入悬浮液体积1/2 的氨水，再在l〇〇°C下搅拌反应40min得到磁流体，然后将磁流体在1~2T的磁场条件下静 置完成磁分离，再对磁流体进行固液分离，所得固体先用乙醇和去离子水交替洗涤数次后， 再用去离子水洗涤，即得包裹后的纳米磁性微球Fe 304; (3) 纳米微球的功能化修饰： 按0. 6:200和固液比g/mL计，将步骤（2)所得包裹后的纳米磁性微球Fe304超声分散于 甲醇中，再按包裹后的纳米磁性微球Fe304与N-异丙基丙烯酰胺的质量比为0. 6:4. 05加入 N-异丙基丙烯酰胺，按包裹后的纳米磁性微球Fe304与偶氮二异丁腈的质量比为0. 6:0. 15 加入偶氮二异丁腈，得到反应体系，然后将反应体系置于氮气保护下以70°C反应12h，后将 反应物置于乙醚中进行反复沉淀，直到无沉淀析出；将所得沉淀物进行真空干燥，即得到交 联固定脂肪酶的超顺磁载体。所得交联固定脂肪酶的超顺磁载体为淡黄色的固体粉末，其 粒径为300~400nm。
[0017] 所得超顺磁载体0. 5g分散在浓度为0. 9wt%的氯化钠溶液中，再在60°C条件下，加 入5mL YZ02脂肪酶（Bacillus pumilus，酶活为600U)和10ml的戊二醛，于反应釜中搅拌 2h，并经磁分离后用乙醇对固体洗涤，最后经冷冻干燥，即得到固定后的脂肪酶。通过对硝 基苯酚法测定，固定化酶活