一种利用纤维二糖生产β-葡萄糖苷酶的钩状木霉菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及葡萄糖苷酶制备领域，尤指一种能够利用纤维二糖发酵生产 0 -葡萄糖苷酶的菌株，具体地指一种发酵纤维二糖生产0 -葡萄糖苷酶的钩状木霉菌 (Trichodermahamatum)YYH13菌株。
【背景技术】
[0002]目前，纤维素酶在纤维素降解方面已经被广泛接受的观点是内切葡聚糖酶（EC 3. 2. 1. 4)和外切葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 91)协同降解纤维素产生大量纤维二糖，过量纤维二 糖的存在对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶会产生反馈抑制作用，降低整个纤维素酶系降解 纤维素底物的效率。然而，葡萄糖苷酶（EC3. 2. 1.21)能够降解纤维二糖，从而能同时 解除纤维二糖和纤维寡糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的反馈抑制。
[0003] 0 _葡萄糖苷酶被认为是整个纤维素降解过程的关键限速酶，能控制降解速率。尽 管已经有商业化的纤维素酶试剂，但其中关键的葡萄糖苷酶的活性却不高，葡萄糖 苷酶在与其它酶进行复配时远远不能满足要求，这主要是由于0 _葡萄糖苷酶的需求高但 活力低造成的问题，这较大地增加了木质纤维素降解的成本。此外，木质纤维素降解过程一 般为酸性环境，也加大了寻找合适纤维素酶的难度。因而发现活力更高、更能够合适于木质 纤维素降解的纤维素酶，尤其是0 _葡萄糖苷酶，成为目前木质纤维素降解研究中一个期 待解决的难题。因此，筛选有效利用纤维二糖转化生产葡萄糖苷酶的菌株是实现木质 纤维素燃料乙醇发酵工业化的关键条件。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种可代谢纤维 二糖的钩状木霉菌（Trichodermahamatum)YYH13菌株，该菌株能以纤维二糖为底物单一发 酵生产葡萄糖苷酶。
[0005] 本发明所述的钩状木霉YYH13(Trichodermahamatum)YYH13,已于2015年6月 30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉.武汉大学，保藏编号为 CCTCCNO:M2015416。
[0006] 本发明菌株YYH13具有如下性质：
[0007] 本发明菌株YYH13于28°C在PDA固体培养基平板上生长，菌落干燥、粗糙，可见明 显的白色菌丝和绿色孢子；在显微镜下观察可见菌丝的营养阶段为丝状体，无游动细胞，属 于无性阶段（图1)。在扫描电子显微镜下可以更加清晰观察到本发明菌株YYH13的个体形 态，其菌丝体发达，分生孢子梗上形成分生孢子可确定其属于丝孢目，且菌丝体是正直和纵 横交错的分支（图2)。
[0008] 用SDS法提取本发明菌株的总DNA，采用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，扩增片 段测序，得到的ITS序列通过BLAST比对从GenBank搜索与该菌株比较接近的菌株，采用 ClustalX软件进行序列比对，利用MEGA4. 1软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育 树（图3)。结合形态特征的检测结果以及ITS序列分子鉴定，确定本发明菌株为钩状木霉(Trichodermahamatum)的一个新种，命名为钩状木霉菌（Trichodermahamatum)YYH13。
[0009] 将本发明菌株YYH13以1 % -2%的接种量接入纤维二糖基础培养基中发酵培养， 能利用纤维二糖发酵生产葡萄糖苷酶。发酵条件为：纤维二糖浓度10_20g/L、温度 28-32°C、时间24-72h、转速140-180r/min。以纤维二糖为唯一碳源进行葡萄糖苷酶发 酵正交试验，优化发酵条件，确定发酵的最佳条件为：纤维二糖浓度15g/L、温度28°C、时间 48h、转速 180r/min。
[0010] 本发明菌株YYH13是对纤维二糖有单一发酵能力的天然菌株，不仅很好地解决了 纤维二糖对内切葡聚糖和外切葡聚糖酶的反馈抑制作用，从而降低木质纤维素降解的成 本，更可以为后续在此基础上进一步优化改良高效木质纤维素降解菌奠定基础，为直接利 用木质纤维素降解产物发酵生产乙醇提供了可能性，为解决目前木质纤维素原料生产燃料 乙醇过程中纤维素和半纤维素的共利用提供了技术支持。同时，钩状木霉菌利用纤维二糖 转化0 _葡萄糖苷酶的特性，对该微生物的应用领域有了新的研究方向。
【附图说明】
[0011] 图1是本发明菌株在PDA固体培养基上培养的菌落特征照片。
[0012] 图2是本发明菌株的扫描电镜照片。
[0013] 其中：A:菌丝；B:孢子。
[0014]图3是本发明菌株的ITS序列系统发育树。
[0015]图4是本发明制作的葡萄糖标准曲线图。
【具体实施方式】
[0016] 以下对本发明作进一步地说明。
[0017] 实施例1本发明菌株的制备
[0018] 以湖南省永州市江永县水稻种植区中采集的土壤为供试材料，取已干燥的供试材 料土样20g，160rpm/min振荡培养30min，制成10 1倍稀释液。然后，分别将10 1倍的菌悬 液稀释至10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8。将各个处理的稀释液分别涂匀在PDA培养基 上于28°C培养3d，挑取单菌落进行单孢分离纯化，如此反复直至菌种纯化，即可得到本发 明菌株。
[0019] 用SDS法提取本发明菌株的总DNA，采用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增。PCR反应 体系总体积为25yL:(ITS1引物体积1yL、ITS4引物体积1yL、dNTP体积1yL、样本体积 1UL、Taq酶缓冲液体积2. 5yL、TaqDNA聚和酶体积0. 5yL、去离子水体积18yL)，DNA 纯度约1. 78。PCR反应程序：（I)为预变性，温度95°C，时间3min;(II)为变性-退火-延 伸循环阶段，变性温度94°C，时间lmin，退火温度55°C，时间50秒，延伸温度72°C，时间45 秒，35个循环；（III)为终延伸阶段，温度72°C，时间lOmin。
[0020] PCR扩增产物采用DNA凝胶回收试剂盒进行割胶回收。纯化产物连接到 pMD18-T_Vecter，连接产物转化到EscherichiacoliDH5a感受态细胞，进行氨卡青霉素 选择和蓝白斑的筛选。挑取单克隆菌液进行测序。经测序，将该序列与GenBank数据库 中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的DNA序列，构建系统发育 树，如图3所不。结果显不，该囷株属于钩状木霉种，将其命名为钩状