一种cTnI半合成人源化单链抗体的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种构建cTnl蛋白的单链抗体T突变体库的方 法，由该抗体库获得的可与人cTnl蛋白特异结合的单链抗体及其该抗体的制备方法及应 用。
【背景技术】
[0002] 急性心肌梗塞（AMI)是临床常见的急性多发病，正确诊断及时救治对挽救濒死心 肌，改善预后降低急性期病死率具有重要意义。在AMI的生化诊断方面，肌酸激酶（CK)及 其同工酶（CK-MB)是目前常用的指标，但是CK-MB并非心脏所特有，在正常人骨骼中也有少 量存在。非心脏手术或骨骼肌损伤患者常有CK-MB增高，且CK-MB在AMI发病后4-8小时 才开始升高，持续时间短（48-72小时），因而临床应用受到限制。
[0003] 肌钙蛋白（Troponin，Tn)是横纹肌收缩的重要调节蛋白，由三个亚基组成：肌钙 蛋白C(TnC)，肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白I(Tnl)。TnC，是肌钙蛋白的Ca2+结合亚基。Tnl 是肌动蛋白抑制亚基。正常情况下Tnl常与TnC或TnT形成复合物，AMI后cTnl的释放形 式迄今为止还不完全清楚。TnT可能为不对称蛋白结构，是原肌球蛋白结合亚基。心肌肌 ?丐蛋白（CardiacTroponinCTn)是心肌收缩的调节蛋白，存在于心肌收缩蛋白的细肌丝 上。肌f丐蛋白的作用之一是把原肌凝蛋白（Tropomyosin.Tm)附着于肌动蛋白（Action.A) 上，三者共同组成细肌丝。肌钙蛋白I(TroponinITnl)为ATP酶的抑制性亚单位，分别定 位于骨骼肌快肌，慢肌和心肌中，其中心肌肌钙蛋白（cTnl)在基因上有着独特的氨基酸序 列，分子量24KD，以两种形式存在于心肌，少量以游离形式存在于细胞胞浆，大部分以结合 形式存在于肌原纤维上。cTnl在胎儿及健康或疾病状态的成人骨骼肌中不表达，因此具有 高度心肌特异性。
[0004] 50年代，医学上的一大进展就是动态测定酶活性的变化来诊断急性心肌梗塞。至 今国内各试验室仍将激酸肌酶（CK)及其同工酶（CK-MB)，乳酸脱氢酶（LDH)，天冬氨酸转移 酶（AST)和a-羟丁酸脱氢酶（HBDH)作为诊断AMI的生化指标。其中尤以CK和LDH及其 同工酶CK-MB最有临床意义。文献上曾以系列测定CK-MB作为发病24小时内诊断AMI的 金标准。但上述酶的测定存在着不足，如：诊断特异性差，早期诊断灵敏性不高，诊断窗口时 间较短。因此国内外都在寻找更加敏感和特异的标志物。目前的研究多集中在心肌固有蛋 白上，主要有肌f丐蛋白，肌红蛋白（myoglobin)，肌球蛋白轻链（MLC)等，其中研究较多并得 到广泛肯定的是肌钙蛋白复合物。
[0005] 19世纪80年代人们制备出抗cTnI多克隆抗体。其方法是用纯化的cTnI做为 抗原免疫家兔或羊制备cTnI抗血清，再用硫铵沉淀法，离子交换层析法，亲合层析法纯化 出抗血清中的IgG。多克隆抗体的最大特点是这些IgG分子可与cTnI分子上不同的抗原 决定族结合，即该IgG具有不同结合位点的IgG分子的混合物，因此其特异性差，与sTnI 显示一定的交差反应。这直接影响到抗原抗体反应的特异性。
[0006]目前cTNI抗体的制备均采用小鼠杂交瘤技术，用杂交瘤技术分泌的抗体具有鼠 源性，无法用于临床诊治，限制了该抗体的应用。同时用杂交瘤技术筛选的单克隆抗体一般 只能保持其天然抗体的活性，制备工作异常繁琐和费时，杂交瘤细胞使用几代后就逐渐退 化，产量变低，使得生产成本增加。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种抗cTnl半合成人源化单链抗体细菌表达株 Autodisplay-cTnI-Anti-ScFv2A_2〇
[0008] 本发明的另一目的在于提供由细菌表达株Autodisplay-cTnI-Anti-ScFv2A_2制 备的半人源化抗cTnl单链抗体。
[0009] 本发明提供一种抗cTnl半合成人源化单链抗体的制备方法，所得抗体能够与 cTnl特异性结合。
[0010] 本发明提供的抗体与cTnl特异性结合，亲和常数为6. 02X10iVol/L。
[0011] 本发明所述抗体其氨基酸序列及核苷酸序列如序列表所示。所述抗cTnl蛋白单 链抗体是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变 区与所述轻链可变区之间；重链可变区N端第36至162位所述氨基酸残基序列；轻链可变 区N端第183位至248位所示氨基酸残基序列。
[0012] 进一步，本发明提供一种抗cTnl蛋白单链抗体突变体库，所述抗体突变体库 含有抗cTnl蛋白抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区linker序列，以 pRSF-Autodisplay为载体，库容量达到2X105。
[0013] 提供所述抗cTnl蛋白单链抗体突变体库的构建方法，包括以下步骤：
[0014] 1.构建竞争性表达载体pRSF-Autodisplay。
[0015] 2.从文库中筛选出的scFv片段进行ErronPCR，扩增抗体重链和轻链可变区基 因：设计含Sfil酶切位点的引物。
[0016] 3.单链抗体scFv突变体库的构建：双酶切scFv基因片段，并插入pRSF Autodisplay构建重组质粒，转化感受态E.coliTurbo,获得抗cTnl蛋白单链抗体突变体 库。
[0017] 本发明的有益效果是：目前用杂交瘤技术筛选的单克隆抗体一般只能保持其天然 抗体的活性，且制备工作异常繁琐和费时，杂交瘤细胞使用几代后就逐渐退化，产量变低， 使得生产成本增加。本发明的单链抗体（ScFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区（VH) 和轻链可变区（VL)通过一段连接肽（Linker)连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的 抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到。采用 erronPCR技术，使得获取比天然抗体亲和性更高的抗体成为可能。本发明提供的抗体与库 中其它抗体相比，氨基酸序列突变5. 2%，而抗体亲和力提高了一个数量级（数据未提供）。 发明提供的抗体片段可在细菌中经济地大规模生产，从而使得免疫检测用抗体的生产变 得非常容易、简便和经济，进而大大减少检测试剂的费用。
【附图说明】
[0018]图 1 为PCR扩增得到 cTnl-Anti-ScFv2A-2片段
[0019] 图2为纯化的 cTnl-Anti-ScFv2A-2的 SDS-PAGE电泳图
【具体实施方式】
[0020] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0021] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0022] 实施例1 :cTNI单链抗体库的构建
[0023] 1.本发明将分别提取20名男性和女性成人脾脏及淋巴结mRNA，合并后将其逆转 录成cDNA。利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH和VL基因片段，将两种 ErrorpronePCR产物进行纯化并测定浓度，再用含柔性连接肽的引物将VH和VL基因片段 通过连接片段组装到一起形成单链抗体编码序列。将单链抗体编码片段ScFv纯化并与载 体PPNL6连接，通过高效醋酸锂转化法转化进入EBY100酵母中，构建半合成抗体文库。
[0024] 2.用磁珠法和流式细胞术筛选结合进行筛选：
[0025]A?体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原；
[0026]B.将磁珠与cTNI蛋白结合，借助抗原与抗体特异性结合，经过3轮"吸附-洗 脱-扩增"循环，实现对单链抗体的富集筛选。
[0027] C.cTNI蛋白用荧光素FITC标记，单链抗体会竞争性的与靶抗原进行结合，被流式 细胞分选仪分选出来。
[0028] D.流式细胞分选以后，随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检 测表达抗体的特异性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。
[0029] 实施例2cTNI单链抗体突变体库的构建
[0030] 1.构建用于细菌中的竞争性表达载体pRSF-Autodisplay。
[0031]2.初步筛选的阳性菌株进行PCR，获得阳性菌株pPNL6-ScFv的DNA片段。
[0032] 3.设计含Sfil酶切位点的引物，对该DNA片段进行ErronPCR，扩增抗体重链和 轻链可变区基因。
[0033] 4.cTNI单链抗体scFv突变体库的构建：双酶切scFv基因片段，并插入 pRSF-Autodisplay构建重组质粒，转化感受态E.coliTurbo细胞，获得抗cTnl蛋白单链抗 体突变体库。
[0034] 5.利用磁珠法单链抗体突变体库进行富集筛选。
[0035] 6.随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检测表达抗体的特异 性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。
[0036] 实施例3抗体的制备
[0037] 1.对阳性菌株进行重复试验，确定稳定性最好的阳性菌株，将其命名为 Autodisplay-cTnI-Anti-ScFv2A-2,提取该质粒DNA，序列测定得到其相应的核苷酸序列。 该单链抗体由重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区顺次连 接组成。重链可变区N端第36至162位所述氨基酸残基序列；轻链可变区N端第183