复制缺陷型黄病毒疫苗和疫苗载体的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请日为2009年3月16日、国际申请号为PCT/US2009/001666、进 入国家阶段的申请号为200980116782. 2、发明名称为"复制缺陷型黄病毒疫苗和疫苗载体" 的PCT申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及复制缺陷型黄病毒疫苗和疫苗载体，和对应的组合物和方法。
【背景技术】
[0003] 黄病毒分布于全世界，且代表一个全球性公共卫生问题。黄病毒作为兽医病原体 也具有重要影响。黄病毒病原体包括黄热病（YF)、登革热型l-4(DENl-4)、日本脑炎（JE)、 西尼罗河（WN)、蜱传脑炎（TBE)和来自TBE血清复合物的其它病毒，例如基亚萨努森林病 (KFD)和鄂木斯克出血热（0HF)病毒。可得到抗YF[减毒活疫苗（LAV)菌株17D]、JE[灭活疫 苗（INV)和LAV]和TBE(INV)的疫苗。目前不可得到许可的抗DEN和WN的人疫苗。兽医疫 苗已经在使用，包括，例如，在亚洲分别用于预防马的脑炎和猪的死产的抗马的WN(INV，重 组的和活的嵌合疫苗）、JE(INV和LAV)的疫苗，在英国用于预防绵羊的神经学疾病的抗羊 跳跃病黄病毒的疫苗（INV)，和在捷克共和国用于耕种动物的抗TBE的疫苗（INV)(Monath 和Heinz，Flaviviruses，见Fields等人编，FieldsVirology，第 3 版，Philadelphia，New York，Lippincott-RavenPublishers，1996,961-1034 页）〇
[0004] 蜱传脑炎（TBE)是人类的最重要的蜱传播的病毒病。它是欧洲和北亚的部分地 方的地方病，每年造成超过10, 〇〇〇人住院治疗，在欧洲的病死率是〇. 5-1. 5%，在西伯利亚 和远东是6-40%。高比例的患者遭受长期的神经精神病学后遗症。已经证实，在鸡胚细 胞培养物中生产的灭活疫苗可以有效地预防该病。例如，覆盖奥地利人口的86% (在欧洲 国家中最高）的疫苗接种，已经导致住院病例减少了约90% (Heinz和Kunz，Arch.Virol. Suppl. 18 :201-205,2004)。灭活疫苗是昂贵的，且初次免疫需要接种3次。需要周期性加 强（每隔2-5年）来维持免疫。因此，需要花费更低的TBE疫苗，其在1-2次给药后是有效 的，且提供持久的、例如终身的免疫（类似于用YF17D免疫接种实现的免疫），实际上已经 被WHO鉴定为特别优选。在过去的几个世纪，借助于TBE病毒亲本本身的经验的或理性的 减毒，或TBE或兰加特（LGT，与TBE密切相关（血清学地）的天然减毒的黄病毒）病毒与登 革热4病毒的嵌合，对TBELAV候选物的开发，已经面临困难，这是由于候选物的残余毒力 和/或低免疫原性/过度减毒的问题（Wright等人，Vaccine26 :882_890, 2008;Maximova 等人，J.Virol. 82 :5255_5268,2008;Rumyantsev等人，Vaccine24 :133_143,2006;Kofler 等人，Arch.Virol.Suppl. 18 :191-200, 2004 ;和其中的参考文献）。
[0005] 黄病毒是小的、有被膜的、正链RNA病毒，主要通过节肢动物媒介（蚊子或蜱）传 递到天然宿主，后者主要是脊椎动物，例如各种哺乳动物，包括人类和禽类。黄病毒基因组 RNA分子的长度是约11，000个核苷酸（nt)，且包括长开放读码框（0RF)，后者侧接长度分别 为约120和500个核苷酸的5'和3'不翻译末端区域（UTR)。所述0RF编码多蛋白前体， 后者在翻译同时和翻译后被切割，产生单个病毒蛋白。以下述次序编码蛋白：C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5,其中C(核心/衣壳）、prM/M(膜前/膜）和E(被膜）是结 构蛋白，即病毒颗粒的组分，而NS蛋白是非结构蛋白，其参与细胞内病毒复制。黄病毒复制 发生在胞质中。在感染细胞并翻译基因组RNA后，多蛋白的加工从多蛋白的prM部分易位 进受感染的细胞的内质网（ER)内腔开始，随后是E和NS1部分的易位，这由prM、E和NS1 蛋白的疏水信号指导。prM、E和NS1蛋白的氨基末端由细胞信号肽酶切割产生，该酶位于 ER膜的腔侧上，得到的单个蛋白保持羧基末端锚定在膜中。非结构区中的大部分剩余切割 由病毒的NS2B/NS3丝氨酸蛋白酶来完成。该病毒蛋白酶也负责产生在后代病毒体中发现 的成熟C蛋白的C-末端。新合成的基因组RNA分子和C蛋白形成致密的球形核衣壳，后者 被其中嵌入E和prM蛋白的细胞膜包围。通过切割prM生成成熟的M蛋白，之后不久由细 胞的弗林蛋白酶或类似的蛋白酶释放出病毒。E(被膜的主要蛋白）是中和抗体的主要靶 物，是抗黄病毒感染的免疫的主要关联物。病毒特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞（CTL)应 答是免疫的其它关键特质。已经在不同的黄病毒结构和非结构蛋白中表征出多种CD8+和 CD4+CTL表位。另外，先天的免疫应答有助于病毒清除和调节适应性免疫应答和免疫记忆的 发展。
[0006] 除了上面讨论的抗黄病毒的灭活的（INV)和减毒活的（LAV)疫苗以外，已经开发 出其它疫苗平台。一个实例是基于嵌合的黄病毒，其包括黄热病病毒衣壳和非结构序列和 来自寻求免疫的其它黄病毒的prM-E蛋白。该技术已经用于开发抗登革热（DEN)、日本脑 炎（JE)、西尼罗河（WN)和圣路易脑炎（SLE)病毒的疫苗候选物（参见，例如，美国专利号 6, 962, 708和6, 696, 281)。基于黄热病病毒的嵌合黄病毒已经在临床试验中产生了非常有 前景的结果。
[0007] 另一种黄病毒疫苗平台是基于假感染病毒（PIV)技术的应用（Mason等人， Virology351 :432-443, 2006;Shustov等人，J.Virol. 21 :11737-11748, 2007;Widman等 人，Adv.Virus.Res. 72 :77-126, 2008;Suzuki等人，J.Virol. 82 :6942-6951，2008;Suzuki 等人，J.Virol. 83 :1870-1880,2009;Ishikawa等人，Vaccine26 :2772-2781，2008;Widman 等人，Vaccine26:2762-2771，2008)。PIV是通过删除减毒的复制缺陷型病毒。不同于活 的黄病毒疫苗，它们在体内经历单轮复制（或任选地有限轮数，对于双组分构建体；参见下 文），其可以提供安全性方面的益处。PIV也不诱导病毒血症和全身感染。此外，不同于灭 活的疫苗，PIV会模仿完整病毒感染，由于有力的B-和T-细胞应答的诱导，这可以导致增加 的功效、更高的免疫持久性和降低的剂量需求。类似于完整病毒，PIV疫苗靶向抗原呈递细 胞例如树突细胞，刺激toll-样受体（TLRs)，并诱导平衡的Thl/Th2免疫。另外，已经证实， PIV构建体可以在基质细胞中生长至高滴度，几乎没有或根本没有细胞病变效应（CPE)，这 允许高产率生产、任选地多次收获和/或繁殖受感染的基质细胞。
[0008] 在图1和2中解释了PIV技术的原理。该技术存在两种变体。在第一种变体中， 构建大量缺失衣壳蛋白（C)的单组分假感染病毒（s-PIV)，使突变体病毒不能在正常细胞 中形成感染性病毒颗粒（图1)。所述缺失不去除C蛋白的前~20个密码子（它们含有 RNA环化序列）和在C末端的类似数目的密码子（它们编码病毒蛋白酶切割位点和prM的 信号肽）。s-PIV可以繁殖，例如，在生产过程中，在其中以反式提供C蛋白的基质（辅助） 细胞培养物中，例如，在生产C蛋白（或包含C蛋白的更大辅助盒）的稳定转染的细胞中， 或在含有表达C蛋白的a病毒复制子[例如，委内瑞拉马脑炎病毒（VEE)复制子]或另一 种表达C蛋白的细胞内表达载体的细胞中。在体内接种后，例如，免疫接种后，PIV在没有 反式互补缺失的情况下在受感染的细胞中经历单轮复制，不扩散至周围细胞。受感染的细 胞生成空的病毒样颗粒（VLP)，它们是PIV中的prM-E基因的产物，导致中和抗体应答的诱 导。通过病毒表位的MHCI呈递，也会诱导T-细胞应答。该方案已经应用于YF17D病毒和 WN病毒和WN/JE和WN/DEN2 嵌合病毒（Mason等人，Virology351 :432-443, 2006;Suzuki 等人，J.Virol. 83 :1870-1880,2009;Ishikawa等人，Vaccine26 :2772-2781，2008;Widman 等人，Vaccine26 :2762-2771，2008 ;W0 2007/098267 ;W0 2008/137163)。
[0009] 在第二种变体中，构建双组分PIV(d-PIV)(图2)。用2种缺陷型病毒RNA转染基 质细胞，一种缺失C基因，另一种缺失prM_E被|旲蛋白基因。2种有缺陷的基因组彼此互补， 导致2类PIV在细胞培养基中累积（Shustov等人，J.Virol. 21 :11737-11748,2007;Suzuki 等人，J.Virol.82 :6942-6951，2008)。任选地，可以在适当的辅助细胞系中分开生产2种 PIV，然后在双组分制剂中混合。后者可以提供下述优点：调节两种组分的相对浓度，增加免 疫原性和功效。由于有些细胞在接种部位被两种组分共感染，这类PIV疫苗在体内应当能 经历有限的扩散。预期这种扩散是自限制的，因为在组织中存在比起初共感染的细胞生产 的病毒颗粒更多的细胞。另外，相对高的M0I对于有效的共感染而言是必需的，预见到在接 种部位以外的细胞不会被有效地共感染（例如，在排出淋巴结中）。仅被ACPIV感染的细 胞生成高免疫原性的VLP。共感染的细胞生成两类包装的有缺陷的病毒颗粒，它们也刺激中 和抗体。预期有限的感染会导致比s-PIV更强的中和抗体应答和T-细胞应答。为了降低 在生产过程中或在体内重组的机会（包括与循环的黄病毒），可以在s-PIV和d-PIV中修 饰病毒序列，例如，使用同义密码子替换来减少核苷酸序列同源性，和突变互补的环化5'和 3'元件。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了复制缺陷型（或有缺陷的）假感染黄病毒，其包含黄病毒基因组，后 者包含：（i)编码一种或更多种选自下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突 变：衣壳（C)、膜前（prM)、被膜（E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白 5(NS5)，和（ii)编码一种或更多种异源病原体、癌症或变态反应相关免疫原的序列。例如， 所述缺失/突变可以是在衣壳（C)序列；膜前（prM)和/或被膜（E)序列；衣壳（C)、膜前 (prM)和被膜（E)序列；或非结构蛋白1(NS1)序列内。
[0011] 异源免疫原可以来自，例如，选自下述的病原体：狂犬病病毒（例如，狂犬病病毒G 蛋白表位），博氏疏螺旋体（例如，OspA免疫原，或其免疫原性片段），蜱（例如，选自64TRP、 Isac和Salp20的蜱唾液蛋白，或其免疫原性片段），流感病毒（例如，流感病毒M2,血凝素 (HA)，或神经氨酸酶（NA)表位，或其免疫原性片段），人免疫缺陷病毒（例如，密码子优化 的HIVgag、tat/nef?或gpl20蛋白，或其免疫原性片段），猿免疫缺陷病毒，人乳头状瘤病毒 (例如，HPV16或HPV18衣壳蛋白L1或L2,或其免疫原性片段），呼吸道合胞病毒（例如，呼 吸道合胞病毒F或G糖蛋白），疟原虫，和结核分支杆菌（也参见下文）。
[0012] 复制缺陷型假感染黄病毒可以包含编码膜前（prM)和/或被膜（E)蛋白的序列。 此外，复制缺陷型假感染黄病毒基因组可以选自下述病毒的基因组：黄热病病毒，西尼罗河 病毒，蜱传脑炎病毒，兰加特病毒，日本脑炎病毒，登革热病毒，和圣路易脑炎病毒，它们的 减毒株，和它们的嵌合体（也参见下文）。在不同的实施例中，所述嵌合体包括：第一种黄 病毒（例如，蜱传脑炎病毒或兰加特病毒）的膜前（prM)和被膜（E)序列，和第二种不同黄 病毒（例如，黄热病，西尼罗河，或兰加特病毒）的衣壳（C)和非结构序列。
[0013] 复制缺陷型假感染黄病毒基因组可以包装在颗粒中，所述颗粒包含与基因组相同 或不同的来自黄病毒的膜前（prM)和被膜（E)序列。此外，可以在一种或更多种蛋白缺失 或突变的位置，或与之组合地，插入编码异源免疫原的序列。
[0014] 编码异源免疫原的序列可以插入黄病毒基因组中的编码被膜（E)蛋白的序列内， 编码非结构1(NS1)蛋白的序列内，编码膜前（prM)蛋白的序列内，基因间地插入编码被膜 (E)蛋白和非结构蛋白1(NS1)的序列之间，基因间地插入编码非结构蛋白2B(NS2B)和非结 构蛋白3(NS3)的序列之间，和/或作为黄病毒基因组的3'非翻译区中的双顺反子插入。
[0015] 本发明也包括组合物，其包含如上所述的第一种复制缺陷型假感染黄病毒，和第 二种（或其它）不同复制缺陷型假感染黄病毒，后者包含含有编码一种或更多种选自下述 的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的基因组：衣壳（C)、膜前（prM)、被膜 (E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)。在这些组合物中，第二 种不同复制缺陷型假感染黄病毒中由发生缺失或突变的序列编码的一种或更多种蛋白不 同于第一种复制缺陷型假感染黄病毒中由发生缺失的序列编码的一种或更多种蛋白。
[0016] 本发明另外包括在受试者中诱导对免疫原的免疫应答的方法，它包含，给所述受 试者施用一种或更多种如本文所述的复制缺陷型假感染黄病毒和/或组合物。在不同的实 施例中，所述受试者处于病原体感染或与癌症或变态反应相关免疫原有关的疾病或病症的 危险中，但是不患有。在其它实施例中，所述受试者具有病原体感染或与癌症或变态反应相 关免疫原有关的疾病或病症。本发明因而包括预防和治疗方法。在这些方法中，所述免疫 原可以来自，例如，选自下述的病原体：狂犬病病毒，博氏疏螺旋体，蜱，流感病毒，人免疫缺 陷病毒，猿免疫缺陷病毒，人乳头状瘤病毒，呼吸道合胞病毒，疟原虫，和结核分支杆菌（也 参见下文）。此外，所述方法可以用于诱导抗黄病毒基因组编码的蛋白（除了免疫原来源 之外）的免疫应答。在不同的实施例中，所述受试者处于与假感染黄病毒的基因组（其包 含编码黄病毒膜前和/或被膜蛋白的序列）相对应的黄病毒的感染的危险中，但是不患有。 在其它实施例中，所述受试者具有与假感染黄病毒的基因组（其包含编码黄病毒膜前和/ 或被膜蛋白的序列）相对应的黄病毒的感染。
[0017] 本发明也包括活的、减毒的嵌合黄病毒，其包括黄热病病毒，其中编码膜前和被膜 蛋白的序列被替换为蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列，且所述嵌 合黄病毒的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列包括黄热病病毒和蜱传脑炎或兰加特病毒衣 壳/膜前信号序列的杂种，或其变体。在不同的实施例中，嵌合黄病毒的衣壳/膜前信号序 列包括在氨基末端区域中的黄热病病毒序列和在羧基末端区域中的蜱传脑炎或兰加特病 毒序列（参见下文）。
[0018] 此外，本发明包括活的、减毒的嵌合黄病毒，其包括西尼罗河病毒，其中编码膜前 和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎或兰加特病毒的编码膜前和被膜蛋白的序列，且所述 嵌合黄病毒的衣壳和膜前蛋白之间的信号序列包括蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信 号序列，或其变体。
[0019] 本发明也包括药物组合物，其包括一种或更多种本文所述的假感染黄病毒、组合 物、或活的、减毒的黄病毒，和药学上可接受的载体或稀释剂。此外，所述组合物可以包括佐 剂。
[0020] 本发明也包括复制缺陷型假感染黄病毒，其包含黄病毒基因组，后者含有在编码 非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)或非结构蛋白5(NS5)的核苷酸序列中的一个或更 多个缺失或突变。
[0021] 此外，本发明包括核酸分子，其与假感染黄病毒的基因组或本文所述的活的、减毒 的黄病毒的基因组相对应，和其补体。
[0022] 本发明也提供了制备本文所述的复制缺陷型假感染黄病毒的方法，该方法包含， 将如上所述的一个或更多个核酸分子导入细胞中，所述细胞表达与复制缺陷型假感染黄病 毒的黄病毒基因组中缺失的任意序列相对应的蛋白。在这些方法中，所述蛋白可以在细胞 中从第二种（或其它）不同复制缺陷型假感染黄病毒的基因组表达。在其它实施例中，所述 蛋白从复制子（例如，a病毒复制子，例如委内瑞拉马脑炎病毒复制子；参见下文）表达。
[0023] 本发明也包括含有2种或更多种复制缺陷型假感染黄病毒的组合物，其中2种复 制缺陷型假感染黄病毒选自：(a)包含含有日本脑炎病毒序列的基因组的复制缺陷型假感 染黄病毒，和包含含有登革热病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒；(b)包含含 有黄热病病毒序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，和包含含有登革热病毒序列的基 因组的复制缺陷型假感染黄病毒；和（c)包含含有蜱传脑炎或兰加特病毒序列和编码博氏 疏螺旋体免疫原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒，和包含含有蜱传脑炎或 兰加特病毒序列和编码蜱唾液蛋白免疫原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病 毒，或包含含有蜱传脑炎或兰加特病毒序列和编码博氏疏螺旋体免疫原和蜱唾液蛋白免疫 原的插入序列的基因组的复制缺陷型假感染黄病毒。
[0024] 本发明也包括药物组合物，其含有本文所述的活的、减毒的嵌合黄病毒。此外，本 发明包括在受试者中诱导对蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的免疫应答的方法，该方法包含， 给所述受试者施用这样的药物组合物。在不同的实施例中，所述受试者处于发展蜱传脑炎 病毒或兰加特病毒感染的危险中，但是不患有。在其它实施例中，所述受试者被蜱传脑炎病 毒或兰加特病毒感染。
[0025] 本发明另外包括复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自 下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳（C)、膜前 (prM)、被膜（E)、非结构蛋白1 (NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中所述黄 病毒基因组包括其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎病毒或兰加特病毒的 编码膜前和被膜蛋白的序列的黄热病病毒序列，且编码黄病毒基因组的衣壳和膜前蛋白之 间的信号序列的序列包括编码黄热病病毒和蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列 的序列杂种，或其变体。在不同的实施例中，所述编码黄病毒基因组的衣壳/膜前信号序列 的序列包括在5'区的黄热病病毒序列和在3'区的蜱传脑炎或兰加特病毒序列。
[0026] 此外，本发明包括复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自 下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳（C)、膜前 (prM)、被膜（E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中所述 黄病毒基因组包括其中编码膜前和被膜蛋白的序列被替换为蜱传脑炎或兰加特病毒的编 码膜前和被膜蛋白的序列的西尼罗河病毒序列，且编码黄病毒基因组的衣壳和膜前蛋白之 间的信号序列的序列包括编码蜱传脑炎或兰加特病毒衣壳/膜前信号序列的序列，或其变 体。
[0027]另外，本发明包括复制缺陷型假感染黄病毒，其包含含有编码一种或更多种选自 下述的蛋白的核苷酸序列中的一个或更多个缺失或突变的黄病毒基因组：衣壳（C)、膜前 (prM)、被膜（E)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5(NS5)，其中黄病 毒基因组中的任意衣壳（C)和非结构（NS)蛋白来自兰加特病毒，且任意膜前（prM)和被膜 (E)蛋白来自蜱传脑炎病毒。
[0028] "复制缺陷型假感染黄病毒"或"PIV"是指，由于黄病毒基因组中的缺失和突变，复 制有缺陷的黄病毒。所述缺失或突变可以是，例如，大序列的缺失，例如本文所述的大部分 衣壳蛋白（保留环化序列；参见下文）。在其它实施例中，缺失编码不同蛋白（例如，prM， E，NS1，NS3,和/或NS5 ;参见下文）或蛋白组合（例如，prM-E或C-prM-E)的序列。如果 PIV要用作递送异源免疫原的载体，这类缺失可能是有利的，因为缺失可以允许插入例如至 少多达缺失序列的大小的序列。在其它实施例中，突变可以是，例如，点突变，条件是，它导 致如上讨论的复制缺陷。因为缺失和突变，基因组不编码生成完整黄病毒颗粒所需的所有 蛋白。缺失序列可以由构建成表达该缺失序列的补偿细胞系以反式提供（例如，利用复制 子；s-PIV;参见下文），或通过2个复制缺陷型基因组在相同细胞中的共表达，其中所述2 个复制缺陷型基因组当一起考虑时，会编码生产所需的所有蛋白（d-PIV系统；参见下文）。
[0029] 在导入不表达补偿蛋白的细胞中后，基因组复制，且在有些情况下，产生"病 毒-样颗粒"，它们从细胞释放出来，且能离开细胞和成为免疫原性的，但是不能感染其它细 胞和导致其它颗粒的生成。例如，在包含