一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluE1及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluEl 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素是地球上最丰富的可再生资源，而来源于低成本的可再生纤维素资源的生 物制品和生物能源对于人类的可持续发展是很重要的。如果能充分的利用纤维素资源，将 对缓解全球的能源危机，食品和饲料资源紧张以及环境污染有重大意义。
[0003] 纤维素酶系广泛存在于多种微生物中，由三种酶组成：内切-l，4-0-D-葡 聚糖酶（end〇-l，4-0-D_glucanases，EC3.2.1.4，EG) ;1，4-0_D-纤维二糖水解 酶（l，4-0-D-cellobiohydrolases，EC3.2.1.91，CBH) ;1，4-0_D-葡萄糖昔酶 (l，4-0-D-glucosidases，EC3. 2. 1. 21，BGL)。纤维素通过这三种酶的协同作用，最终 降解为葡萄糖（OKSANENT,PEREJ,PAAVILAINENL,etal.Journalofbiotechnolo gy，2000,78(l) :39-48.)。其中内切-l，4-0-D-葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分， 它首先作用纤维素，随机水解纤维素分子内部的0-1，4_糖苷键，将纤维素链打断，它对 整个纤维素的降解起到至关重要的作用。近年来，内切葡聚糖酶的应用已经越来越广 泛，如纺织，生物质能，造纸和食品工业等（BE⑶INP，AUBERTJ-P.FEMS，microbiology reviews, 1994, 13(1) :25-58.)。目前，许多研究都集中在强耐热性的纤维素酶上，原因在 于其在各种工业过程中潜在的应用，如对木质纤维性生物转化成发酵性的产品，改善动 物饲料的消化率和果汁的澄清，并减少在造纸工业所需的氯等（BHATM.Biotechnology advances, 2000, 18(5) : 355-383.)。
[0004] 现如今对纤维素酶研究的范围越来越广泛，但是，一直以来纤维素酶的降解速率 和高生产成本成了充分利用纤维素资源的限制因素；现如今所研究的纤维素酶难以满足食 品、化工等工业快速发展，以及环境可持续、健康发展的需求，偏中性耐盐性较强的内切葡 聚糖酶目前研究的还很少，因此，开发有此种特性的内切葡聚糖酶并将其应用于工业领域， 将有很好的前景和价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluEl及其制备方法，旨 在解决将纤维素酶更广泛，更高效的应用于各种工业领域。
[0006] 本发明是这样实现的，一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluEl，该偏中性耐盐性内 切葡聚糖酶GluEl得自脂环酸芽孢杆菌D-1 ;
[0007] 内切葡聚糖酶GluEl总共含339个氨基酸，理论分子量为40. 45kDa，GluEl不含 信号肽。GluEl可水解CMC-Na、可溶性淀粉、大麦葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖和微晶 纤维素，表观最适pH为6. 5,在pH5.0-pH10.0的范围内稳定并维持60 %以上的酶活性。 GluEl的表观最适温度为55°C，在37°C下稳定。GluEl受Ag+、Hg2+及SDS抑制，-巯基乙 醇、Pb+、Mg2+、Ca2+和Na+对GluEl有微弱的促进作用；其余金属离子和有机试剂对GluEl的 影响不大。3%-30%的NaCl对GluEl的影响不大，加入30%的NaCl，仍有64%以上的酶 活性；经3% -30%的NaCl在37°C下处理60min，仍能保持93%以上的活性；体现了较强的 耐盐性，用中性内切纤维素酶处理后的棉织物效果好，对织物损伤小，防沾色效果优良；
[0008] GluEl具有良好的pH稳定性和大部分的金属离子抗性，因此，GluEl可作为良好的 出发材料，通过进一步的突变等研究以提高高温活性等，最终使其在中温到高温的生境和 加工过程中具一定的应用潜力，纤维素是植物细胞壁的主要组成部分，利用纤维素酶能有 效的应用于植物中有益营养成分的提取，GluEl表现出了较强的耐盐性，这使得内切葡聚糖 酶能应用于从盐含量较高的植物中提取有用物质成为可能。
[0009] 进一步，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluEl对CMC-Na、可溶性淀粉、大麦 0 _葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖和微晶纤维素的比活分别为5. 902±0. 331U/mg， 6. 362±0. 331U/mg，130. 655±0. 694U/mg，6. 117±0. 598U/mg，6. 974±0. 371U/mg和 11.384±1.5811]/1职，表观最适口11为6.5，在口115.〇11110.0的范围内稳定并维持60%以 上的酶活性。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种一种偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluEl的制备 方法，该偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluEl的制备方法包括以下步骤：
[0011] 步骤一，用重组载体转化宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表 达质粒转化大肠杆菌细胞BL21，进行阳性克隆子验证并送测序，得到重组菌株BL21 (DE3) / gluEl；
[0012] 步骤二，培养重组菌株，诱导内切葡聚糖酶基因gluEl表达；取重组大肠杆菌菌株 BL21 (DE3)/gluEl，以0? 1%的接种量接种于LB(含lOOmg/mLAmp)培养液中，37°C快速振荡 16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB(含100mg/mLAmp)培养液中，快 速振荡培养约2 - 3h(0D6。。达到0. 6 - 1. 0)后，加入终浓度0. 7mmol/L的IPTG进行诱导，于 20°C继续振荡培养约20h。9500g离心5min，收集菌体；
[0013] 步骤三，回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶GluEl。（用适量的pH7.OMcIlvaine buffer悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经12000r离 心10min，吸取上清并用Nickel-NTA树脂纯化目的蛋白。纯化的蛋白进行12%的SDS-聚 丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分析和Bradford法蛋白定量。）
[0014] 进一步，内切葡聚糖酶基因编码的内切葡聚糖酶以大麦葡聚糖为底物：最适 pH6. 5,最适温度55°C;在pH为6. 0~7. 0的范围内酶活稳定。
[0015] 进一步，通过PCR的方法分离克隆了内切葡聚糖酶GluEl的编码基因gluEl，全长 1020bp，GC含量50. 5%，编码339个氨基酸。
[0016] 进一步，将重组载体优选为pEASY-E2-gluEl。将本发明的内切葡聚糖酶基因插入 到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施 方案，将本发明的内切葡聚糖酶基因和表达载体PEASY-E2通过T-A方式相连接，得到重组 大肠杆菌表达质粒。
[0017] 本发明还提供了包含上述内切葡聚糖酶基因gluEl的重组菌株，优选所述菌株为 大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/gluEl。
[0018] 本发明的另一目的在于提供一种所述的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluEl，其最 适pH为6.5;最适温度为55°C;较强的耐盐性和金属离子抗性。本发明的内切葡聚糖酶可 应用于饲料、食品、洗涤等行业。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明实施例提供的偏中性耐盐性内切葡聚糖酶GluEl的制备方法流程 图；
[0020] 图2是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组内切葡聚糖酶GluEl的 SDS-PAGE分析示意图；
[0021] 图中：1、蛋白质Marker;2、500mM味唑洗脱亲和于Nickel-NTAAgarose中的重组 内切葡聚糖酶GluEl;
[0022] 图3是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluEl的pH活性示意图
[0023] 图4是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluEl的pH稳定性示意图；
[0024] 图5是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluEl的最适温度示意图；
[0025] 图6是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluEl的热稳定性示意图；
[0026] 图7是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluEl的NaCl抗性示意图；
[0027] 图8是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluEl的NaCl稳定性示意 图；
[0028] 图9是本发明实施例提供的纯化的重组内切葡聚糖酶GluEl在不同时间下水解大 麦0 _葡聚糖的产物分析示意图；
[0029] 图中：CK为大麦0 -葡聚糖和失活的GluEl(100°C下处理5min)。
【具体实施方式】
[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0031] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0032] 本发明的目的是提供一种偏中性耐盐性较强的内切葡聚糖酶GluEl。
[0033] 本发明的再一目的是提供编码上述内切葡聚糖酶的基因。
[0034] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0035] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0036] 本发明从脂环酸芽抱杆菌0_1(厶1：[05^1(^&(3；[11118七61^(31101^61181806]\0^1504) 的基因组中克隆到内切葡聚糖酶基因gluEl，属于GH5家族的内切葡聚糖酶。gluEl与表达 载体PEASY-E2连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对其酶学性质进行了初步 研究。
[0037] 本发明所述内切葡聚糖酶GluEl可得自脂环酸芽孢杆菌D-UAlicyclobacillus sp.)。GluEl的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0038] 本发明的内切葡聚糖酶GluEl总共含339个氨基酸，理论分子量为40. 45kDa， GluEl不含信号肽。该酶对CMC-Na、可溶性淀粉、大麦葡聚糖、昆布多糖、燕麦木聚糖 和微晶纤维素的比活分别为 5. 902±0. 331U/mg，6. 362±0. 331U/mg，130. 655±0. 694U/mg， 6. 117±0. 598U/mg，6. 974±0. 371U/mg和 11. 384±1