一种gii.4型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GII. 4型诺如病毒基因组扩增引物和扩 增方法。
【背景技术】：
[0002] 诺如病毒是全球流行性与散发性急性胃肠炎的重要病原，每年造成约2. 3亿人次 染病，在发展中国家尤为严重，至少导致20万例5岁以下儿童的死亡，对公共卫生安全造成 了极大的威胁。诺如病毒感染为自限性疾病，但对于婴幼儿、老人及免疫缺陷人群会具有脱 水性死亡的危险。至目前为止，还没有有效的抗病毒药物及治疗手段。
[0003] 作为RNA病毒，诺如病毒极易变异，具有丰富的遗传多样性。根据其衣壳蛋白序列 同源性可将病毒分成6个基因组（Genogroup)，基因组之间的核酸序列同源性约46%，其中 G I、G II和G IV为人源病毒。同一基因组内的核酸同源性为69%~97%，进一步分成不 同的基因型（Genotype)，例如GI含有8个基因型，GII含有19个（并不断增加）。其中， GII. 4型是目前全球主要流行基因型，近80%的诺如病毒感染是由该型别毒株引起的，并 且该病毒每隔两三年就会产生新的变异株，同时造成新一轮的大范围病毒流行。
[0004] 尽管最近在人源诺如病毒培养方面有了突破性进展，但是合适的复制体系仍然 缺乏。因此，基因组信息的获得对于诺如病毒研究具有重要意义。诺如病毒基因组长约 7. 5-7. 8kb，包括3个开放阅读框。目前报道的基因组扩增方法有直接扩增法以及分段扩增 法。其中，直接扩增方法往往难以具有较高的灵敏度，对待处理样本的质量具有较高的要 求，因而不具有较高的成功率。另外，分段扩增法中常用的包括三段法以及多段法，而多段 法的引物一般根据与待处理样本中病毒相似度高的基因组序列进行设计，因而对引物的广 谱性也造成了一定的限制；三段法中扩增获得的片段长度较大（>3K)，这不但增加了扩增 的难度，而且难以直接测序，从而降低了获得病毒基因组序列的成功率。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种高灵敏度的GII. 4型诺如病毒基因组扩增引物和扩增 方法。
[0006] 本发明的GII. 4型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物：
[0007]引物对 1:P1F:5，-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3'；
[0008] P1596R：5r -TCGACGCCATTGCGTGGGA-3r；
[0009]引物对 2:P1258F:5' -CAACCATATGACCACCTTGCT-3' ；
[0010] P2805R：5r -ATGGCCACCTCCTCATAGTA-3r；
[0011]引物对 3:P2689F:5' -AGGTCTCAGTGATGAAGAG-3，；
[0012] P4248R ： 5r -GGGCCATCCTCATTCATATTCA-3r ；
[0013]引物对 4:P4099F:5' -TGGTAAGATCAAGAAGAGGCT-3，；
[0014] G2SKR：5r -CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3r；
[0015]引物对 5:NV2of2:5，-GGAGGGCGATCGCAATC-3，；
[0016] GV132：5, -CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3r；
[0017]引物对 6:P6484F:5' -CAGCACAATCTGATGTGGC-3'；
[0018] P7513R:5' -TTACACCCGTGACTCCCCT-3，。
[0019] 本发明的第二个目的是提供一种GII. 4型诺如病毒基因组的扩增方法，其特征在 于，分别以上述引物 P1F/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/ GV132和P6484F/P7513R作为扩增引物的上下游引物，以GII. 4型诺如病毒的RNA为模板进 行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测定，然后再拼接比对， 得到GII. 4型诺如病毒基因组全长序列。
[0020] 优选，所述的RT-PCR，其反应体系为：含有2 X one-stepRT-PCR mixture 10 y L， 10 y mol/L上游引物和10 y mol/L下游引物各0. 6 y L，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液 0. 8 y L，RNA模板2 y L，其余由双蒸水补足至20 y L，反应条件为：50°C反转录30min，94°C预 变性 3min，然后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 80s，共 30 次循环后，72°C最后延伸 7min。
[0021] 本发明针对GII. 4型诺如病毒主要流行基因型，根据基因组所包含的三个开放 阅读框设计了 "4+1+1"的分段扩增策略，并根据保守区域设计相应的扩增引物；在优化反 应条件的基础上，各对引物均达到了与常规检测引物相同的扩增灵敏度，能有效的扩增出 GII. 4型诺如病毒的全基因组序列。本发明可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病 毒检测需求及相应的科研领域。
【附图说明】：
[0022] 图1是适用于GII. 4型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR退火温度优化，电 泳顺序为M，1-36,其中M为DNA Ladder，1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36分别为引 物P1F/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132、P6484F/ P7513R在不同退火温度（依次为50 °C、52 °C、54°C、56 °C、58 °C、60 °C)下扩增产物的电泳结 果。
[0023] 图2是适用于GII. 4型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度分析，电泳顺 序为M，1-42。其中M为DNA Ladder，1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42分别为基 因组扩增引物PlF/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132、 P6484F/P7513R和检测引物G2SKF/G2SKR在病毒RNA不同稀释度（依次为101-106倍稀 释）下扩增产物的电泳结果。
[0024] 图3是实际样本中病毒基因组的扩增效果，电泳顺序为M，1-30。其中M为DNA Ladder，1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30依次为实际样本110、162、165、1106、1232进 行4+1+1策略扩增基因组6个产物的电泳结果。
【具体实施方式】：
[0025] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0026] 以下实施例所使用的GII. 4型诺如病毒基因组扩增引物，具体如下：
[0027]引物对 1:P1F:5，-GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3'；
[0028] P1596R：5r-TCGACGCCATTGCGTGGGA-3r；
[0029] 引物对 2:P1258F:5' -CAACCATATGACCACCTTGCT-3' ；
[0030] P2805R ： 5r -ATGGCCACCTCCTCATAGTA-3r ；
[0031] 引物对 3:P2689F:5' -AGGTCTCAGTGATGAAGAG-3，；
[0032] P4248R ： 5r -GGGCCATCCTCATTCATATTCA-3r ；
[0033] 引物对 4:P4099F:5' -TGGTAAGATCAAGAAGAGGCT-3，；
[0034] G2SKR:5， -CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3，；
[0035]引物对 5:NV2of2:5，-GGAGGGCGATCGCAATC-3，；
[0036] GV132:5, -CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3' ；
[0037] 引物对 6:P6484F:5' -CAGCACAATCTGATGTGGC-3' ；
[0038] P7513R:5' -TTACACCCGTGACTCCCCT-3，。
[0039] 实施例1 :
[0040] 适用于GII. 4型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR退火温度优化
[0041] (1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液（pH7. 4, DEPC处理）稀释收集的待 处理样品（含有GII.4型诺如病毒L10)至10% (w/v)浓度，充分振荡混匀，于12000Xg下 离心10min收集上清液140 y L，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60 y L。
[0042] (2) "4+1+1"基因组分段扩增法（即分6段扩增，所使用的引物配组如下：P1F/ P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 P6484F/P7513R， 每次RT-PCR反应选择一对引物）：采用20 y L的一步法RT-PCR反应体系，含有2 X one-step RT-PCR mixture 10yL，上游引物和下游引物（10ymol/L)各 0.6yL，MLV/RNasin/HS-Taq 酶混合液0. 8 y L，样本病毒RNA模版2 y L，其余由ddH20补足。
[0043] 反应条件为：50°C 反转录 30min，94°C