溶栓酶基因qk-02的表达方法及专用表达载体和工程菌的制作方法
【专利说明】溶栓酶基因QK-02的表达方法及专用表达载体和工程菌 【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的是指一种溶栓酶基因QK-02的表达方法及专用 表达载体和工程菌。 【【背景技术】】
[0002] 由于遗传背景较清楚，大肠杆菌作为基因克隆受体的首选菌株已被广泛应用于基 因工程中，并取得了许多重大成果。大肠杆菌表达具有以下优势：目标基因表达水平高；表 达系统成熟完善；易于培养（培养方法简单、生长快、培养周期短、抗污染能力强）、成本低； 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。然而，其表达也有一些缺点，如缺乏翻译后加 工修饰，易形成包涵体蛋白，不利于后续的操作等。
[0003] 枯草杆菌溶栓酶（Bacillus subtilis QK02,保存序列号：CCTCC NO :M203078)是 通过检测降解纤维蛋白能力的方法筛选到的，研究表明，该酶具有较强的纤溶活性，可产生 大量的溶栓酶QK，是一种潜在的溶栓药物，它不仅具有良好的溶栓效果，而且可经口服达到 纤溶目的，其特性优于当前临床应用的溶栓药物，如链激酶、尿激酶等。发明人还发现该酶 在体内外及血管内皮细胞中具有拮抗由血红素、NaNOjP H 202带来的损伤的能力。目前，该 酶主要来源于野生枯草芽孢杆菌发酵的纳豆、豆豉等，但是纳豆、豆豉的风味还不能被许多 人所习惯和接受，从发酵液中分离纯化枯草杆菌溶栓酶通常产量较低、生产成本高，这些因 素都在一定程度上限制了枯草杆菌溶栓酶的开发和应用。 【
【发明内容】
】
[0004] 有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供一种溶栓酶基因QK-02的表达方 法及专用表达载体和工程菌。
[0005] 为实现上述目的，本发明所提供的溶栓酶基因QK-02的专用表达载体，所述载体 在细胞周质中高水平表达重组蛋白，引导重组蛋白分泌到培养基中，其特征在于：所述载体 由pET40b表达载体和溶栓酶基因经过Sal I/EcoR I酶切后重组而成；所述载体基于T7启 动子通过添加lac操纵子改造成为IPTG诱导的启动子；所述载体具有His标签、肠激酶酶 切位点，具有卡那霉素抗性，可表达出DsbC(二硫键异构酶）融合蛋白。
[0006] 作为优选方案，所述载体中含有DsbC融合蛋白。
[0007] 进一步地，本发明还提供一种用于表达枯草杆菌溶栓酶的工程菌，是将上述枯草 杆菌溶栓酶的专用表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中得到的重组菌。可采用生 物工程领域中常用的方法，例如CacV法、电穿孔转化法、原生质体转化法等将所构建的重 组表达载体导入BL21 (DE3)感受态细胞中。
[0008] 本发明还提供一种溶栓酶基因QK-02的表达方法，是发酵上述工程菌，经诱导后， 再对发酵产物通过肠激酶酶切及镍柱的分离纯化得到qk-02。
[0009] 进一步地，它包括如下步骤：
[0010] (1)从枯草杆菌Bacillus sutilisQK-02中提取基因组DNA，并利用PCR扩增得到 DNA片段（即qk基因）；
[0011] (2)将qk基因克隆到表达载体pET40b中，然后转化到克隆菌株DH5a感受态中， 筛选阳性克隆DH5a -qk ;
[0012] (3)将阳性重组克隆DH5a-qk转化到表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，并用 IPTG诱导表达重组蛋白酶，SDS-PAGE及Western blot法检测蛋白大小，BCA方法检测蛋白 浓度；
[0013] (4)重组蛋白的分离纯化：用肠激酶酶切，His标签鎳柱及透析浓缩纯化的方法得 到较纯的重组蛋白qk，SDS-PAGE检测；
[0014] (5)诱导表达条件的优化：加入IPTG，所加入IPTG的浓度为0.1-lmM，诱导温度为 16-37°C，诱导时间为3-16小时；并进行Western及SDS-PAGE的检测。
[0015] 进一步地，所述步骤（5)中加入IPTG的浓度为0? 5mM，诱导温度为22°C，诱导时间 为12小时。
[0016] 本发明所提供的枯草杆菌溶栓酶的表达方法，是诱导表达上述枯草杆菌溶栓酶的 专用表达工程菌，再通过肠激酶酶切，分离纯化得到枯草杆菌溶栓酶。
[0017] 本发明的优点在于：本发明的用于表达枯草杆菌溶栓酶的载体，是新的载体 pET40b允许在细胞周质中高水平表达重组蛋白。这种表达系统不同于传统的原核表达，能 正确折叠二硫键，不需要复性就可以得到具有活性的多肽，相对而言简单有效，减少了样本 在分离纯化、复性等过程中的损耗以及获得正确活性蛋白的不确定性。本发明的表达载体， 高活性，抗氧化，无致病性，高分泌特性，可以直接将功能性胞外蛋白酶分泌到细胞周质中， 大大增加了融合蛋白的可溶性，提高了蛋白的活性，避免了包涵体溶解及复性带来的麻烦， 成本低。因此，该酶在心血管疾病治病中有重要的应用价值。 【【附图说明】】
[0018] 图1为枯草杆菌溶栓酶诱导型表达载体pET40b(+)示意图。
[0019] 图2为枯草杆菌溶栓酶PCR后结果图。图中：M:Marker 1、2均为QK-02DNA样品。
[0020] 图3为pET40b的酶切鉴定结果。图中：M:Marker 1为没有酶切的载体片段，2为 双酶切后结果。
[0021] 图4为枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导表达的Western结果。
[0022] 图5为枯草杆菌溶栓酶在大肠杆菌中诱导型表达产物酶切后的SDS-PAGE检测结 果。
[0023]图6为分泌表达的枯草杆菌溶栓酶的蛋白平板活性检测结果。
[0024] 图7为检测温度、诱导时间和IPTG浓度对枯草杆菌溶栓酶诱导分泌表达影响的结 果。
[0025] 表1为枯草杆菌溶栓酶QK-2纯化结果。 【【具体实施方式】】
[0026] 下面结合附图和具体实例对本发明进行详细的说明。
[0027] 实施例一：枯草杆菌QK-02的制备过程
[0028] (1)取水稻叶85°C热处理10分钟，用其包裹灭过菌的大豆，42°C培养24小时，后 用培养液浸泡培养过的大豆，将浸泡过大豆的培养液作10 2~10 6稀释，涂布营养琼脂平 板，37°c倒置培养后在平板上长出菌落。
[0029]所获的菌落分别接种在5ml培养液中37 °C，250rpm培养24h后，6000rpm离心 5min。取20ul上清液在纤维蛋白平板上测定溶栓酶活性，然后选择酶活性最高的菌株。
[0030] 实施例二：编码溶栓酶QK的基因qk的PCR扩增和克隆及序列测定
[0031] 枯草杆菌Bacillus Subtilis QK-02的基因组DNA提取按照常规方法（Saito， H.et al，1963, Biochim.Biophys. Acta 72:619-629)来进行。
[0032] PCR扩增的引物设计：
[0033] 引物 P1 :5 ' ACGCGTCGACATGGCGCAATCTGTTCCTTACGGC
[0034] 引物 P2 :3 ' CCGGAATTCTAGCTATTATTGTGCAGCTGC
[0035] 扩增出的片段大小为828bp
[0036] PCR扩增反应体系50ul体系中：5ul枯草杆菌基因组DNA作为模板，引物P1、 P2(10uM)各 lul，10XPCR 缓冲液 5ul，dNTP(2mmol)5ul，K0D 酶 0? 5ul，其余用无菌水补足。 反应程序为：94￡€51^11，941€3〇8,56°(：1〇8,74 1€3〇8,35个循环，741€6111111。扩增产物在 1%琼脂糖凝胶电泳中检测。结果见图2。
[0037] 扩增产物和pET40b载体（图谱见图1)都经Sal I，EcoR I双酶切，胶回收后16°C 连接过夜，〇&(：12法转化到DH5 a细胞中，转化产物涂布到含有卡那（Kan)抗生素的LB琼脂 平板上，筛选重组子，37°C培养14-16h，挑选阳性克隆，提质粒双酶切鉴定（结果见图3)，并 送测序。
[0038] 实施例三：重组表达质粒qk的诱导表达
[0039] (1)将克隆后的重组质粒pET40b用钙转的方法转化入大肠杆菌表达菌株 BL21 (DE3)感受态细胞中，涂布平板，筛选阳性重组子并鉴定。
[0040] (2)表达载体pET40b受T7启动子控制，用该载体构建的表达质粒在不同温度下 IPTG诱导表达。挑取单个阳性菌落接种于2mlLB培养基中，置摇床37°C过夜活化，然后以1: 50的比例稀释到新鲜LB培养基中，37°C培养至A600 = 0.8~1.0,加入不同浓度的IPTG， 分别诱导不同时间梯度，在3h，5h，7h，12h后分别离心收集菌体，用1 XPBS溶解，超声波破 碎，4°C离心取上清，Western检测蛋白表达（条带见图4)，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
[0041] (3)采用纤维蛋白平板法估测枯草杆菌溶栓酶活性。将2ml纤维蛋白原溶液 (50mg/ml)加入40ml琼脂糖溶液（0. 75% )中，混匀后取8m