重组表达载体及其构建方法、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及亚单位疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物病毒学和基因工程学技术领域，特别涉及重组表达载体及其构建 方法、重组病毒毒株及其应用、重组蛋白及亚单位疫苗。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)是一种高度接触性疾病。主要表现为母猪繁殖障碍 及育肥猪和小猪呼吸困难。GP5是PRRSV重要的糖蛋白，能够诱导中和抗体的产生及免疫保 护。因此可作为研究对抗PRRSV的基因工程疫苗的主要靶位点。虽然灭活和修饰后的活疫 苗可以利用，但是其保护性不完整。因此探索和研发出对抗PRRSV感染的有效疫苗是一项 十分紧迫的任务。
[0003] 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2 virus，简称PCV2)是引起仔猪断 奶后多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic syndrome，PMWS)的主要病原，弓丨 起断奶仔猪发生进行性消瘦、咳嗽、呼吸困难等。目前PCV2已在世界各地广泛存在并流行， 给全球养猪业造成巨大的经济损失。猪圆环病毒2型基因组含有两个主要的开放阅读框， 即0RF1和0RF2,其中0RF2是构成病毒衣壳蛋白（Cap)的主要成分，其主要定位于细胞质膜 上，具有自我装配成病毒样粒子.并且经研究证实0RF2蛋白中含有可中和病毒的中和抗原 表位，因此，是设计新型疫苗的首选目标基因。
[0004] 作为RNA病毒，PRRSV的基因在合成时容易出现内在性错误，可出现点突变，删除、 添加和毒株间基因重组，而灭活疫苗诱导细胞免疫的能力较弱，产生的保护作用较短，蓝耳 病还存在"抗体依赖性增强作用"。又因为PCV2可导致蓝耳病的发生和发展，所以利用基因 工程方法研制PRRSV和PCV2二价亚单位疫苗将成为彻底防制该病的重要方向。因此，该亚 单位疫苗在猪蓝耳病和猪圆环病的防制方面将具有很广泛的应用前景。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供重组表达载体及其构建方法、重组病毒毒株及其应用、重组 蛋白及亚单位疫苗。本发明成功PCR扩增PRRSV-GP5基因和PCV2-Cap基因及构建高效重 组表达质粒BacSC-Dual-GP5_Cap。此外，本发明重组毒株所表达的重组蛋白，其产物表达产 量很高。用研制的BacSC-Dual-GP5-Cap亚单位疫苗制品对本动物是安全的。疫苗免疫效 力试验结果表明，利用基因工程方法研制的PRRSV和PCV2具有良好的免疫原性，该亚单位 疫苗在猪蓝耳病和猪圆环病的防制方面将具有很广泛的应用前景。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种重组表达载体，由具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段、具有如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的PCV2 Cap基因片段与质粒载体重组 构建而成。
[0008] 杆状病毒细胞进入是通过gp64蛋白介导，在宿主细胞表达后，gp64蛋白SS直接 穿过细胞膜，并以三聚体的形式出现于受感染细胞表面，该融合蛋白的表达与本体的糖蛋 白gp64启动后，转入质膜，进入杆状病毒包膜内。以假型杆状病毒作为一个潜在的疫苗传 递系统的方法已被广泛使用。
[0009] 在本发明的一些实施例中，重组表达载体由表达载体BacSC-Dual在其Kpn I和 Sma I酶切位点间插入所述具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5的基因片段， 以及所述表达载体BacSC-Dual在其Pst I和EcoR I酶切位点间插入SEQ ID No. 2所示核 苷酸序列的PCV2 Cap基因片段获得。
[0010] 具体的，重组表达载体由表达载体BacSC-Dual在其Kpn I和Sma I酶切位点间插 入gp64CAD、gp64TM、如 SEQ ID No.l 所示核苷酸序列的PRRSV GP5 基因片段、His6、gp64ss， 以及所述表达载体BacSC-Dual在其BamH I和Hind III酶切位点间插入gp64ss、His6、SEQ 10如.2所示核苷酸序列的？(^2 0&口基因片段4口6肛114口6扣40获得。
[0011] 本发明还提供了一种如上述重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：
[0012] 步骤1 :扩增获得如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段；
[0013] 步骤2 :扩增获得如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5的基因片段；
[0014] 步骤3 :将所述表达载体BacSC-Dual经Xho I、Xba I、Pst I和EcoR分别双酶切， 将如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段与如SEQ ID No. 1所示核苷酸序 列的PRRSV GP5的基因片段转化连接，获得所述重组表达载体。
[0015] 在本发明的一些【具体实施方式】中，构建重组表达质粒BacSC-Dual-GP5_Cap包括：
[0016] 1、PRRSV-GP5基因和PCV2_Cap基因的引物设计
[0017] 根据猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白基因和猪圆环病毒2型的Cap基因序列设计特 异性引物P1、P2、P3和P4,引物序列如下：
[0018] 6卩5-卩1:如 SEQ ID No. 4 所示，5' GCTGCGCGCATGAATGGCATCTTC 3'
[0019] GP5-P2Jn SEQ ID No. 5 所示，
[0020] 5, GGGGCATGCAAGTGGGGGGTCTTTAAG 3，，
[0021] Cap-P3:如 SEQ ID No. 6 所示，5' GCTCTCGAGAGCAACAACAGCAG 3'，
[0022] Cap-P4:如 SEQ ID No. 7 所示，5' GATCTGCAGGAGACGACCCCATTGTT3' ；
[0023] 根据杆状病毒BacSC-Dual载体酶切位点，加入酶切位点Xho I、Xba I、Pst I和 EcoR，上述引物均由上海生工生物工程公司合成。以猪蓝耳T1株的GP5蛋白基因和PCV2 豫A株的全基因序列设计特异性引物，并以重组质粒pT-PCV为模板（曹胜波等.猪II型 圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析，以Pl、P2、P3和P4为引物对CP5和Cap基因 进行扩增，扩增目的片段大小分别为507bp和570bp。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳 检测扩增结果。
[0024] 2、重组表达质粒BacSC-Dual-GP5_Cap的构建
[0025] 将PCR扩增的GP5和Cap蛋白基因片段纯化回收，转化至克隆质粒中，经Xho I、Xba I、Pst I和EcoR分别双酶切，后将GP5基因与Cap基因连接，将连接产物克隆至表达载体 BacSC-Dual上，获得天然表达GP5_Cap基因的重组真核质粒BacSC-Dual-GPS-CapaDHlOBac 大肠杆菌分别转化为重组质粒BacSC-Dual_GP5_Cap和非重组质粒BacSC-Dual。非重组质 粒BacSC-Dual作为阴性对照。选择经过两轮蓝/白选择菌落后，按照Invitrogen公司规 定的程序从白色菌落中分离到重组质粒。重组克隆后用P1和P4特异性引物进行PCR验 证。重组杆状病毒DNA分别命名为BacSC-Dual-GP5-Cap与BacSC-Dual。
[0026] 本发明还提供了一种重组病毒毒株，由上述重组表达载体经包装细胞包装而成。
[0027] 在本发明的一些实施方案中，重组病毒毒株的生物保藏编号为CGMCC No. 2389。
[0028] 本发明还提供了上述重组杆状病毒毒株在制备预防和/或治疗PRRSV感染相关疾 病和/或PCV2感染相关疾病的药物制剂的应用。
[0029] 在本发明的一些实施方案中，所述PRRSV感染相关疾病为猪繁殖与呼吸综合征； 所述PCV2感染相关疾病为多系统衰竭综合征。
[0030] 本发明还提供了一种如上述重组病毒毒株表达的重组蛋白。
[0031] 在本发明的一些实施方案中，重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示。
[0032] 此外，本发明还提供了一种亚单位疫苗，包含：
[0033] (I)如上所述的重组病毒毒株表达的重组蛋白或与其同源性达80%以上的蛋白；
[0034] 和 / 或
[0035] (II)如上所述的重组蛋白或与其同源性达80%以上的蛋白。
[0036] 本发明提供了一种重组表达载体，由具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的PRRSV GP5基因片段、具有如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的PCV2 Cap基因片段与质粒载体重组 构建而成。本发明成功PCR扩增PRRSV-GP5基因和PCV2-Cap基因及构建高效重组表达质 粒BacSC-Dual