一种抑制p4hb基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抑制P4HB基因表达的抑制剂及其 在制备用于治疗乙肝的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒HBV基因组仅编码少数蛋白，但需要完成包括入侵、复制、组装和分 泌复杂的病毒生活史，宿主细胞参与了HBV生活周期中各个阶段，HBV的感染过程严重依赖 宿主蛋白和HBV蛋白的直接和间接相互作用，因此作用于宿主细胞因子为治疗HBV感染提 供了靶点。
[0003] 激酶是一类从高能供体分子（如ATP)转移磷酸基团到特定靶分子（底物）的酶， 在细胞信号通路中起着重要的调控作用，参与了细胞地增殖，凋亡，代谢，转移等过程，激 酶抑制剂已成为肿瘤治疗中最重要的一类靶向药物。近些年来，相继发现FAK，Src，PI3K等 激酶参与HBV的感染过程，人的宿主细胞内共有784个激酶，目前仅发现少数激酶与HBV相 关，大多数激酶蛋白在HBV感染过程中的作用尚不明确。
[0004] 在宿主作用因子所参与的病毒感染过程中，自噬（Autophagy)与病毒感染及其引 发的免疫反应密切相关。病毒具有较强的免疫原性，能导致机体产生抗病毒免疫应答，细 胞自噬参与了多种病毒感染后产生的免疫反应，HBV病毒感染细胞后，诱导宿主细胞发生自 噬，产生自噬小泡。因此，研究HBV与细胞自噬的相互作用，不仅有助于阐明HBV病毒感染 的分子机制，更为寻找鉴定治疗HBV的药物靶点提供一个有效的突破口。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抑制P4HB基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝 的药物中的应用，利用本发明所述抑制剂可以有效抑制目的基因P4HB的表达，从而阻断了 宿主激酶与HBV蛋白的作用，有效抑制了HBV细胞的生长。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0007] -种抑制P4HB基因表达的抑制剂，它包括带有有效抑制P4HB基因表达的shRNA 序列的载体，所述shRNA序列为：
[0008] F：
[0009] GATCCGGCGACAGGACGGTCATTGATTAGGTACCTAATCAATGACCGTCCTGTCGTTTTTG；
[0010] R：
[0011] AATTCAAAAACGACAGGACGGTCATTGATTAGGTACCTAATCAATGACCGTCCTGTCGCCG。
[0012] 所述P4HB基因包含有序列为CGACAGGACGGTCAITGATTA的目的基因片段。
[0013] 所述载体为pUCTP。
[0014] 本发明还提供了所述的抑制P4HB基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物 中的应用。
[0015] 将所述shRNA与载体连接后形成慢病毒表达质粒，所述慢病毒表达质粒经扩增后 与包装辅助质粒共转染293T细胞，转染后培养并收集上清病毒粗液，通过超离心浓缩，得 到高滴度的慢病毒浓缩液，将所述慢病毒浓缩液感染带有HBV的宿主细胞。
[0016] 所述扩增为：将所述慢病毒表达质粒转入GeneHogs化学感受态细菌，经PCR扩增 选取阳性克隆后提取的质粒即为扩增后的慢病毒表达质粒。
[0017] 转染后培养48_72h收集上清病毒粗液。
[0018] 所述宿主细胞为IfepG2. 2. 15细胞。
[0019]与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在HBV稳定表达的 IfepG2. 2. 15细胞中，大规模功能性地沉默人基因组中所有激酶基因和自噬基因，经过实验 筛选出的P4HB基因为可以抑制HBV分泌的阳性基因，并且确定出阳性基因P4HB的有效 shRNA片段，本发明系统性阐明激酶以及宿主细胞自噬对HBV复制的影响，揭示了激酶信号 和自噬调控网络在HBV -宿主一肝癌三者之间的关系，为新一代抗HBV治疗提供新药物靶 点和理论依据。
【附图说明】
[0020] 图1是载体pUCTP的构建图谱；
[0021] 图2是菌落PCR的电泳图谱，阳性克隆应扩增出170bp左右片段；Marker从上而 下大小依次为：60(^口/50(^口/40(^口（最亮）/30(^口/20(^口/10(^卩；
[0022] 图3是酶切验证的电泳图谱，每个目的片段选取2个阳性克隆用KPNI酶切 2. 95Kb+7. 5Kb 产生片段；Marker 从上而下依次为：10000bp/8000bp/6000bp/5000bpA 最 亮）/4000bp/3000bp/2000bp/1500bp/1000bp/500bp;
[0023] 图4表明携带目的基因P4HB的慢病毒载体在293T细胞中成功组装；
[0024] 图5是筛选结果Z-score散点统计图；
[0025] 图6是5个阳性基因对应的沉默效率；
[0026] 图7是5个阳性基因对应的HBV分泌抑制率；
[0027] 图8表明含有P4HB的病毒上清液成功转染目的细胞IfepG22. 2. 15。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
[0029] 实施例1
[0030] 本发明的技术方案包括以下实验步骤：
[0031] 1、高通量制备人激酶组RNAi慢病毒文库
[0032] 首先完成784个激酶基因和308个自噬基因（这些基因的基因序列在NCBI中均 已公布）的慢病毒文库构建工作，针对每个基因，设计8条shRNA，编号A-H，以保证每个基 因至少有1-2条shRNA有效抑制其表达。
[0033] 高通量慢病毒包装时，将A-D质粒混合，E-H混合，分别包装，因此每基因针对2个 病毒，分别包含4条shRNA序列；
[0034] (1)慢病毒文库质粒构建
[0035]A. shRNA引物设计与合成（以P4HB为例）
[0036]
[0038] B.载体构建图谱如图1所示，选用的载体为pUCTP。
[0039] C.shRNA 引物退火
[0040]
[0041] D?连接至慢病毒载体pUCTP
[0042] a)连接体系：
[0043]
[0044] b)转化：取5ul连接产物转化GeneHogs化学感受态细菌。
[0045] c)菌落PCR的电泳图谱如图2所示。
[0046] E?酶切验证的电泳图谱如图3所示。
[0047] (2)慢病毒文库包装（以P4HB为例）
[0048] 1)混合质粒包装：
[0049] 慢病毒表达质粒与包装辅助质粒共转染293T细胞
[0050] a、293T细胞的准备：转染前一天，胰酶消化处于对数生长期生长状态良好的293T 细胞，以合适比例接种至96孔板中。
[0051] b、细胞接种24h后，按transfection reagent的说明书进行转染操作。对于1个 孔，所需加入的DNA的总量为0. 1. 25 y g (包含慢病毒表达质粒及3D LV packaging Mix)， 转染试剂3D transfection reagent为0. 25 y 1，稀释病毒液所用的无血清DMEM培养基的 体积为4ylX2。在病毒包装过程中，把A-D shRNA慢病毒质粒混合，E-H混合分别进行包 装病毒，因此每个基因对应两个混合病毒。
[0052] c、转染图片如图4所示，证明携带目的基因P4HB的慢病毒载体在293T细胞中成 功组装。
[0053] 2)病毒液的收集：转染后48h及72h分别收集上清病毒粗液，并于_80°C保持。
[0054] 2、初筛一慢病毒文库感染IfepG2. 2. 15细胞，ELISA检测细胞上清中HBV的含量
[0055] 筛选前，预先进行高通量RNAi条件摸索和ELISA检测条件确定。在96孔板中，使 用含784个激酶基因和308个自噬基因的慢病毒文库感染可以分泌HBV病毒的IfepG2. 2. 15 细胞，并且为了保证筛选实验的可靠性分别在三块板中设置同样的重复。感染120个小时 后，ELISA检测上清中HBV病毒分泌量，同时MTS检测细胞活性，从而得以计算出单位细胞 KW分泌相对值，并计算出每个孔的z-score值，z-score绝对值大于1. 96则表示，在统计 学意义上该基因沉默后可显著影响HBV的分泌。
[0056] 1)慢病毒感染
[0057] A.目的细胞的培养：目的细胞培养于1640+10% FBS+1 % Pen-Str印+1 % NEAA中。
[0058] B.细胞准备：指数期生长、状态良好的目的细胞生长至70%~80%密度时，传代， 并以合适的比例接种于96孔板内，使得第二天细胞密度达10%左右。
[0059] C.细胞接种后第二天，用shRNA慢病毒文库进行感染。
[0060]2)MTT 检测
[0061] 感染后96h后，各孔内（包含blank)加入MTS混合液lOul/lOOul培养基。37°C 孵育0. 5-4h后