用于抑制β淀粉样蛋白聚集的多肽和多肽功能化的金纳米粒子及制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于抑制β淀粉样蛋白聚集的多肽和多肽功能化的金纳米粒子 及制备和应用。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默氏症（AD)是老年痴呆症的最主要发病形式，截止2011年，全球已有 3500万名AD患者，而与AD相关的死亡病例大约有48. 6万例。AD的发病人数已经仅次于癌 症和心脏病，成为最耗费社会财政支出的疾病之一。AD的病理学特征是神经细胞内由tau 蛋白形成的神经纤维扭结以及细胞外的β淀粉样蛋白（Αβ)沉积。Αβ是含有39-43个 氨基酸残基的多肽，由淀粉样前体蛋白（amyloid-β precursor protein，APP)经β和γ 分泌酶依次切割形成。Αβ的两种主要类型分别是Αβ 40和Αβ 42,其中Αβ 40含量较为丰 富，但Αβ42毒性更强。许多研究证明，Αβ的聚集特别是寡聚化过程与AD的发病紧密相 关。因此在Αβ聚集的早期对其进行抑制是可行的治疗手段，能够阻止或延迟AD的发病。
[0003] 研究者已经开发了多种针对Αβ的抑制剂，包括多酚类，多肽及其衍生物，抗体和 纳米粒子等。这些抑制剂在体外试验以及细胞试验中具有一定效果，但他们的生物相容性、 体内稳定性等均存在问题。多肽具有分子量小、无免疫原性及特异性强等特点，且其易于合 成和修饰，理化性质明确。因此可以通过理性设计得到理想的Αβ多肽抑制剂。由于Αβ 的疏水核心序列（KLVFFAE)对Αβ的聚集起重要作用，因此研究者基于此多肽设计开发了 以LPFFD为代表的一系列具有明显抑制A β聚集效果的多肽抑制剂，然而这些多肽抑制剂 存在稳定性差、易被降解和自聚等缺点，至今没有得到实际应用。
[0004] 近年随着纳米技术的发展，纳米粒子在药物递送方面发挥重要作用。特别是金纳 米粒子（GNP)具有低毒性、易于检测和成像、合成方法成熟、能够穿过血脑屏障等特点，常 用于药物递送与机理研究。其表面易于进行功能化修饰。若将多肽抑制剂修饰在纳米粒子 (NP)表面，研发多肽功能化GNP，不但能改善多肽配基的作用效率和溶解性等缺陷，还能引 入纳米效应，利用金纳米粒子的性质，可大大增强其对A β的抑制作用，成为具有前景的治 疗AD的候选药物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，设计合成一种多肽和多肽功能化的金纳米 粒子，并提供多肽功能化的金纳米粒子在制备抑制β淀粉样蛋白聚集药物的用途。
[0006] -种用于抑制β淀粉样蛋白聚集的多肽，具有SEQ ID No. 1氨基酸序列：Val-Va Ι-Ile-Ala-Cys-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp。经实验考查，该多肽自身具有一定的抑制β淀粉 样蛋白聚集的能力。
[0007] 由于多肽功能化的纳米粒子抑制β淀粉样蛋白聚集的效果一般要好于游离多 肽，所以本发明利用上述多肽氨基酸序列制备了功能化的金纳米粒子，其结构表达如下：
[0008]
O
[0009] 本发明的金纳米粒子的制备方法，是从Αβ的经典抑制剂LPFFD和C末端序列 VVIA出发，设计得到特定多肽VVIACLPFFD，并在金纳米粒子表面形成特定的结构。
[0010] 本发明的具体说明如下：本发明所述的多肽功能化的金纳米粒子，所用的纳米粒 子为直径15nm的金纳米粒子（GNP)，所用的特定多肽VVIACLPFFD，具有SEQ ID No. 1氨基 酸序列：Val-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Pr〇-Phe-Phe-Asp〇
[0011] 本发明首先从A β的经典抑制剂LPFFD和C末端序列VVIA出发，经过理性设计得 到特定多肽VVIACLPFFD，这一多肽分子能够同时发挥LPFFD和VVIA的抑制性质，不会彼此 冲突，并能够在金纳米粒子表面形成特定的结构，放大其抑制A β聚集的效果。将其修饰在 直径为15nm的金纳米粒子上，通过多肽自身的抑制作用和与纳米粒子的协同作用，提高其 与Αβ间的相互作用，有效抑制Αβ聚集。
[0012] 优选的制备过程：
[0013] 1)将氯金酸水溶液（浓度为lmmol/L)煮沸回流10-30min ;加入热的柠檬酸钠水 溶液（浓度为38. 8mmol/L，氯金酸水溶液：梓檬酸钠水溶液体积比=10:1)后，持续搅拌回 流30-60min ;反应液冷却后过滤去除沉淀，得到GNP溶液；
[0014] 2)配制多肽VVIACLPFFD的水溶液（浓度为l-3mmol/L);将其加入到l-5nmol/L 的GNP溶液中（多肽水溶液：GNP水溶液体积比=1:10)，室温搅拌反应2-6h (反应时加入 的多肽过量以保证GNP表面的完全修饰）。
[0015] 3)制得的溶液先通过孔径0. 45微米滤膜除去沉淀，随后将滤液使用去离子水透 析3-7天（透析截流分子量3000-10000道尔顿）除去其中残余可溶物，得到多肽功能化的 金纳米粒子水溶液。
[0016] 4)将多肽功能化的金纳米粒子水溶液保存在4°C下。
[0017] 本发明的关键技术有三点，首先是多肽序列的结构，多肽VVIACLPFFD将Αβ的C 末端序列VVIA和Αβ的经典抑制剂LPFFD以半胱氨酸C连接，VVIA的疏水部分和LPFFD 的带电部分暴露在肽链的两端，使得这两个肽段能够发挥各自的作用；其次是当多肽 VVIACLPFFD交联在金纳米粒子上时，交联的位置在半胱氨酸C的侧链巯基上，这时多肽的 两端分别在纳米粒子表面伸展，使得VVIA和LPFFD以一定构象暴露在溶液中，能够同时与 Αβ分子结合，从而加快抑制作用并提高抑制效果；最后是交联以后的多肽功能化的金纳 米粒子在溶液中成稳定的胶体溶液，稳定性相比金纳米粒子大大提高，多肽功能化的金纳 米粒子是单分散的，有利于与尺寸更小的A β聚集体结合并抑制其聚集。
[0018] 本发明的优点：
[0019] 多种实验手段证明，多肽功能化的金纳米粒子能够有效抑制Αβ 42的聚集；改变 了 Αβ 42聚集体的形貌，减少了 Αβ 42纤维的生成；并在低浓度（0. lnmol/L)下有效抑制了 A β 42的细胞毒性。多肽功能化的金纳米粒子作为一种潜在的AD治疗药物，可以有效地抑 制A β 42的寡聚化以及纤维形成过程，并降低A β 42聚集过程中所产生的细胞毒性作用，是 Aβ 42聚集的理想抑制剂。金纳米粒子作为制备治疗阿尔茨海默氏症的药物的应用有广阔 的前景。
【附图说明】
[0020] 图1 :实施例1中多肽功能化的金纳米粒子的透射电镜图
[0021] 图2Α :实施例2中未修饰的GNP的热重分析图
[0022] 图2Β :实施例2中多肽功能化的金纳米粒子的热重分析图
[0023] 图3 :实施例3中0. lnmol/L-3. 5nmol/L浓度的多肽功能化的金纳米粒子与Αβ 42 共培养24h后培养物的ThT荧光图
[0024] 图4A :实施例4中A β 42单独培养24h后培养物的透射电镜图
[0025] 图4B :实施例4中lnmol/L的多肽功能化的金纳米粒子与A β 42共培养24h后培 养物的透射电镜图
[0026] 图5 :实施例5中lnmol/L的多肽功能化的金纳米粒子与A β 42共培养24h后培 养物的粒径分布图。
[0027] 图6A :实施例6中0. lnmol/L-3. 5nmol/L浓度的多肽功能化的金纳米粒子与 A β 42共培养24h后培养物对SH-SY5Y细胞的细胞毒性（MTT实验）。
[0028] 图6B :实施例6中0. lnmol/L-3. 5nmol/L浓度的多肽功能化的金纳米粒子与 A β 42共培养24h后培养物对SH-SY5Y细胞的细胞毒性（LDH释放实验）。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0030] 本发明首先从A β的经典抑制剂LPFFD和C末端序列VVIA出发，经过理性设计得 到特定多肽 VVIACLPFFD 氨基酸序列：Val-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp〇
[0031] 多肽的结构式如下：
[0033] 这一多肽分子能够同时发挥LPFFD和VVIA的抑制性质，不会彼此冲突，并能够在 金纳米粒子表面形成特定的结构，放大其抑制聚集的效果；将其修饰在直径为15nm的金纳 米粒子上，通过多肽自身的抑制作用和与纳米粒子的协同作用，提高其与Αβ间的相互作 用，有效抑制Αβ聚集；结构不意如下：
[0034]
[0035] 本发明的多肽功能化的金纳米粒子的制备方法，其步骤如下：
[0036] 1)将氯金酸水溶液（浓度为lmmol/L)煮沸回流10-30min ;加入热的柠檬酸钠水 溶液（浓度为38. 8mmol/L，氯金酸水溶液：梓檬酸钠水溶液体积比=10:1)后，持续搅拌回 流30-60min ;反应液冷却后过滤去除沉淀，得到GNP溶液；
[0037] 2)配制多肽VVIACLPFFD的水溶液（浓度为l-3mmol/L);将其加入到l-5nmol/L 的GNP溶液中（多肽水溶液：GNP水溶液体积比=1:10)，室温搅拌反应2-6h (反应时加入 的多肽过量以保证GNP表面的完全修饰）。
[0038] 3)制得的溶液先通过孔径0. 45微米滤膜除去沉淀，随后将滤液使用去离子水透 析3-7天（透析截流分子量3000-10000道尔顿）除去其中残余可溶物，得到多肽功能化的 金纳米粒子水溶液。
[0039] 4)将多肽功能化的金纳米粒子水溶液保存在4°C下。
[0040] 利用多种实验手段证明，多肽功能化的金纳米粒子可以有效抑制Αβ 42聚集，并 能降低A β 42聚集过程中所产生的细胞毒性。
[0041] 实施例1 :多肽功能化的金纳米粒子的形貌
[0042] 将多肽功能化的金纳米粒子的水溶液滴加在400目的碳膜铜网上，自然干燥。然 后用透射电镜（Tecnai G2 F20)进行观察，检测电压为200kV，选取放大后标尺为50nm的图 像进行观察，结果如图1所示。
[0043] 由图1可知，多肽功能化的金纳米粒子的形貌为较规则的球形，经过软件分析，多 肽功能化的金纳米粒子的直径为15. 0±1. 2nm。
[0044] 实施例2 :未修饰的GNP和多肽功能化的金纳米粒子的质量变化
[0045] 将未修饰的GNP和多肽功能化的金纳米粒子的水溶液浓缩并冻干成棕色纳米粉 末，放入热重分析仪中进行分析。将纳米粉末由室温程序升温（5°C/min)至900°C，并伴随 氮气吹扫（气速20mL/min)，使GNP表面修饰的多肽分解挥发，记录质量损失。结果如图2 所示。
[0046] 如图2A可知，未修饰的GNP在加热前后质量无明显变化。由图2B可知，多肽功 能化的金纳米粒子在加热以后损失了 2. 148 %的质量。直径15nm的GNP相对分子质量为 20539千道尔顿，损失的分子质量约为441千道尔顿。每修饰一个VVIACLPFFD分子，其分子 量增加1123. 38道尔顿。所以多肽功能化的金纳米粒子的平均修饰率约为400,即平均每个 GNP上修饰了约400个VVIACLPFFD多肽分子。
[0047] 实施例3 :0. lnmol/L-3. 5nmol/L浓度的多肽功能化的金纳米粒子