针对乙肝表面蛋白的双特异性抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了抗乙肝表面蛋白双特异性抗 体制备技术及其在预防HBV感染和治疗HBV相关肝细胞肝癌中的用途。
【背景技术】
[0002] 乙肝病毒Ofepatitis B virus，HBV)是双链DNA病毒，人体被感染后易引起慢性 乙型肝炎，进而导致肝硬化和（或）肝癌。据统计近年来全球约有3.5亿HBV感染者，每年 约有100万~150万人死于急性或慢性HBV感染导致的肝功能衰竭，肝硬化和（或）肝癌， 因而预防HBV感染成为世界公共健康问题[ 1]。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC， 简称肝癌）与病毒性肝炎的关系密切，是病毒性肝炎所引起的最重要死亡原因之一，亦是 临床上最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内是位居第三的肿瘤相关致死原因，每年新发 病例中我国占全球42. 5%，已成为我国第二位的肿瘤病因。
[0003] 研究表明，HBV感染相关HCC患者中，HBV DNA载量高者（>105copies/ml)的HCC 发生率达10. 1%，而HBV DNA载量低者（<104copies/ml)的HCC发生率仅为3. 8%，基线高 病毒载量与HCC发生率升高有关。高病毒载量（HBV DNA彡0. 7mEq/ml)时，HCC复发危险 比为5. 13,切口缘阳性的HCC复发危险比为2. 14。因此，对乙肝患者进行抗病毒治疗，有助 于延缓疾病向HCC的进展。对HBV相关HCC患者进行抗病毒治疗，可通过改善肝功能而提 高生存率。近年的研究显示，高HBV DNA载量与高HCC复发率及预后不良有关。对HBV感 染相关HCC术后患者进行抗病毒治疗可能是除肝移植以外的另一种治疗选择，该治疗可通 过改善肝功能而提高生存率。
[0004] 目前针对HBV感染主要采用α -干扰素和核苷酸类似物等药物抗病毒治疗，但该 两类药物长期使用疗效欠佳，易于导致病毒突变，给治疗带来极大困难[2]。
[0005] 相对于抗病毒感染的药物，乙肝特异性的免疫球蛋白（HBIG)的抗病毒效果好很 多。给予病人乙肝特异性的免疫球蛋白（HBIG)治疗已给被各国的学者广泛关注。诸如， HBIG在乙肝来源的肝癌后肝移植后的研究已达到很好的效果。HBIG是一种高效价的多克 隆外源性抗体，其是从健康献血员中筛选出来，经过生物浓缩工艺制成。当人体感染HBV 时被动地接受这种被动免疫制剂，可使机体能短期内迅速中和并清除血清中游离的乙肝病 毒，避免乙肝病毒定位感染。
[0006] 然而，当前HBIG作为治疗性抗体的来源存在诸多非安全因素。同时，乙肝免疫球 蛋白成分复杂，危险因素相对不确定，生产方式受限，这些因素制约着乙肝治疗性抗体的临 床使用[3]。
[0007] 因此迫切需要研发一种安全有效及危险因素相对可控的生物制品替代人乙肝 免疫球蛋白，所以研发乙肝特异性人源基因工程抗体越来越受到关注。因单克隆抗体具 有特异性强、灵敏度高且易大规模生产等优点，故研发针对乙肝表面抗原（Hepatitis B surface Ag, HBsAg)的单克隆抗体，以期能够安全有效地阻止HBV感染及其相关的肝炎、肝 硬化及肝癌的进程。
[0008] 由于疾病的多因素性，单一靶点治疗往往不能满足临床的需求[4]。在临床试验中 已有联合运用两种单克隆临床前实验的报道 [5]，但这种联合应用单克隆抗体的却有很多限 制性[6]。例如，联合应用两种单克隆抗体的的安全性和效果需要分别去评价，由此产生的长 周期，高昂的开发费用限制其研制进程，而双特异性抗体恰好解决了这一瓶颈 [7]。
【发明内容】
[0009] 本发明是为解决上述问题而进行的，提供了一种针对表面抗原蛋白的双特异性抗 体A3B 5-BsAb,本发明采用了如下技术方案：
[0010] 本发明提供的针对乙肝表面蛋白的双特异性抗体A3B5-BsAb,其特征在于，具有： 重链可变结构域，包含高变区OTR 1、⑶R2、⑶R3、⑶R4、⑶R5、⑶R 6;以及轻链可变结构域，包含 高变区⑶R1' XDR2'、⑶R3'、⑶R4'、⑶R5'、⑶R 6'，重链可变结构域的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6所示，轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0011] 其中，⑶札的氨基酸序列为：Met-Tyr-Ala-Phe-Ser ;Q)R 2的氨基酸序列为 le_I Ie-Pro-Ser-Phe-Asp-Thr-Thr-Asn-Tyr-Ala-Gln-Lys-Phe-Gln-Cys ;CDR3的氨基酸序 列为：Ser-Val-I Ie-Thr-Asp-Leu-Asp-Thr-Val-Gly-Asn-Asp-Glu-Ser-Gly-Asp-Ala-Ser-Tyr-Tyr-Tyr-Met-Asp-Val ;001?4的氨基酸序列为：Ser-Ser-Ala-Ile-Leu ;001?5的氨基酸序 列为：Trp-IIe-Val-Val-Gly-Ser-Gly-Asn-Ala-Lys-Tyr-Ala-Gln-Arg-Phe-Gln-Glu ;CDR6 的氨基酸序列为：Arg-Gly-His-Ser-Phe-Thr-Ser-Pro-Phe-Asp-Ser ;
[0012] CDR1'的氨基酸序列为：Arg-Ser-Ser-Glu-Ser-Leu-Gln-His-Ser-Asp-Gl y-Thr-Tyr-Tyr-Leu-Asp ;CDR2'的氨基酸序列为：Ser-Ala-Ser-Asn-Thr-Ala-Pro ; CDR/ 的氨基酸序列为：Met-Gln-Ala-Leu-Glu-Thr-Pro-Phe-Thr ;CDR / 的氨基酸序 列为：Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Gly-Ser-Asn-Tyr-Leu-Ala ;CDR5'的氨基酸序列为： Gly-Ala-Ser-Thr-Arg-Ala-Thr ;CDR6'的氨基酸序列为：Gln-Lys-Tyr-Gly-Ser-Ser-Leu-Thr0
[0013] 同时，双特异性抗体A3B5-BsAb选自抗乙肝病毒表面抗原的双特异性抗体以及所 述双特异性抗体片段中的任意一种，该双特异性抗体片段为所述双特异性抗体的Fab片段 或F(ab'） 2片段。
[0014] 进一步的，本发明还提供了一种针对乙肝表面蛋白的抗体片段，该抗体片段为双 特异性抗体A 3B5-BsAb的Fab片段或F (ab'）2片段。
[0015] 进一步的，本发明提供了一种编码双特异性抗体A3B5-BsAb的基因，编码重链可变 结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，编码轻链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0016] 进一步的，本发明提供了一种含有至少一个拷贝的上述基因的表达载体。
[0017] 进一步的，本发明提供了一种含有至少一个上述的表达载体的宿主细胞。
[0018] 进一步的，本发明提供了双特异性抗体A3B5-BsAb或其Fab片段或F(ab'） 2片段在 制备预防或治疗乙肝病毒相关肝病的药物或诊断试剂中的用途。所述药物或诊断试剂除包 含抗体或抗体片段外，还包含可药用赋形剂、稀释剂与载体中的任意一种。
[0019] 发明作用与效果
[0020] 本发明提供了一种针对乙肝表面抗原蛋白的双特异性抗体A3B5-BsAb,该双特异性 抗体由抗体A3D5以及抗体B 5H6组合而成，但其中和HBV病毒的能力以及抑制HBsAg释放的 能力较单纯将抗体A3D5以及抗体B5H6联合应用更优，显现出较强的协同效果，进而可能阻止 HBV的感染相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。同时，由于该抗体是从接种乙肝疫苗的志愿 者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞中克隆获得的全人源抗体，其具有较鼠源、嵌合及人 源化抗体更低的免疫原性。
【附图说明】
[0021 ] 图1是本发明的双特异性抗体A3B5-BsAb特异性结合抗原图；
[0022] 图2是本发明的合成肽在乙肝表面抗原（HBsAg)的位置示意图；
[0023] 图3⑷是本发明的双特异性抗体A3B5-BsAb结合抗原表位P 3的结果图；
[0024] 图3 (B)是本发明的双特异性抗体A3B5-BsAb结合抗原表位P2的结果图；
[0025] 图4是本发明的双特异性抗体A3B5-BsAb影响细胞中HBsAg表达的定量检测结果 图；
[0026] 图5是本发明的双特异性抗体A3B5-BsAb影响细胞中HBV DNA复制数的定量检测 结果图；
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