人b淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种人B淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体 及含有该抗体的药物组合物，属于基因工程抗体技术领域。
【背景技术】
[0002] Blys (B淋巴细胞刺激因子），又称BAFF，属于肿瘤坏死因子超家族成员（TNFSF)， 是1999年发现的一种新的细胞因子。人BAFF基因定位于染色体13q32_q34,由6个外显 子和5个内含子组成。其全长蛋白分子由285个氨基酸组成，为II型跨膜糖蛋白，单体成楔 形样的"三明治"结构，缺少N-糖基化位点，跨膜区在47-73位氨基酸，133-285位氨基酸为 其发挥功能的主要区域。可溶型Blys (soluble Blys，s Blys)是由膜型Blys在第132或 133位氨基酸残基发生酶解脱落而形成，两者的生物学活性基本一致。Blys以同源三聚体 的形式发挥生物学作用。Blys的受体共有三种，即TACI、BCMA和BR3,通过与受体结合调节 着机体免疫平衡。
[0003] BLyS作为一种B淋巴细胞的共刺激因子，主要由巨噬细胞和中性粒细胞分泌产 生，在活化的T细胞和树突状细胞中也有少量表达。Blys在B细胞发育、功能调节和自身 免疫性疾病的发病中发挥重要作用，其缺陷或过量表达均可引起机体免疫失衡，从而诱发 多种疾病，可能与某些自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AD)的发生有关。在系统 性红斑狼疮（SLE)、干燥综合征（Sjsngren syndrome，SS)和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA)等疾病患者血清中Blys水平明显升高，进一步证实BAFF过表达参与了这 些疾病的发生和发展。
[0004] 自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AD)是一类机体对自身抗原发生免疫反 应而导致自身组织损害的疾病。常见的全身性自身免疫性疾病有系统性红斑狼疮（SLE)、干 燥综合征（Sjsngren syndrome，SS)和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA)等。目 前，对AD的治疗手段仍处于研究和探索中，主要是依赖免疫抑制剂等药物治疗，但疗程较 长，发生药物不良反应较多见。结合基因工程和蛋白质工程技术的靶向抗体药物治疗正成 为新兴的研究领域，有望为AD治疗提供新的策略。抗体与其靶点的结合是特异性的，能够 起到介导免疫效应机制的作用，并且在血清中具有较长的半衰期。这些特性使抗体具有很 强的治疗应用。
[0005] 目前，FDA于2011年3月9日批准美国人类基因组公司开发的抗Blys单克隆抗体 Belimumab上市，用于治疗SLE，成为50年来首个获准的用于治疗SLE的药物。Belimumab 只针对BLyS刺激的B细胞，与化疗药物相比，大大降低了治疗过程中的副作用，因此为系统 性红斑狼疮患者提供了一个安全有效的治疗方法。由于独家生产，病人需要花费高额的费 用，目前一个病人用药一年的费用约在3万美元左右。所以，研发新的抗Blys单克隆抗体， 从而减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种对Blys抑制活性更高的单克隆抗体。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种抗Blys抗体的重链和轻链可变 区，所述重链可变区的3个互补决定区氨基酸序列分别为，
[0008] CDR-Hl :TFGMN (SEQ ID NO. 1)；
[0009] cdr-h2 Aisx1Gsstiyyadtvkg (seq id no. 2)；
[0010] CDR-H3 :LGDPLLRPKGNAMD (SEQ ID NO. 3)；
[0011] 所述轻链可变区的3个互补决定区氨基酸序列分别为，
[0012] CDR-Ll :LASQTIG X2X3LA (SEQ ID NO. 4)；
[0013] CDR-L2 :AAT X4X5AD (SEQ ID NO. 5)；
[0014] CDR-L3 :QQLYSSPWT (SEQ ID NO. 6)；
[0015] 其中，父丨是S或P ;X 2是T或K ;X 3是W或N ;X 4是S、K或R ;X 5是L、F、K或P。
[0016] X!、X2、X3、X4、X5、分别对应序列表中的 Xaa!、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa50
[0017] 进一步，所述抗Blys抗体的重链和轻链可变区，还包含如（HC-FRl)-(⑶R-H1)_(H C-FR2) - (CDR-H2) - (HC-FR3) - (CDR-H3) - (HC-FR4)式所示在重链的互补决定区之间并置的 可变重链框架区 HC-FRl、HC-FR2、HC-FR3,和 HC-FR4 ;以及如（LC-FRl)-(CDR-Ll)-(LC-FR2 )-(CDR-L2) - (LC-FR3) - (CDR-L3) - (LC-FR4)式所示在轻链的互补决定区之间并置的可变轻 链框架区 LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3,和 LC-FR4。
[0018] 优选的，所述可变重链框架区和可变轻链框架区来自于人胚系（germline)基因。
[0019] 更优选的，至少一个所述可变重链框架区和/或至少一个所述可变轻链框架区的 氨基酸序列如下所示：
[0020] HC-FRl ：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO. 7)；
[0021] HC-FR2 ：WVRQAPGKGLEffVS (SEQ ID NO. 8)；
[0022] HC-FR3 ：RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO. 9)；
[0023] HC-FR4 ：YffGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 10)；
[0024] LC-FRl ：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO. 11)；
[0025] LC-FR2 ：WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO. 12)；
[0026] LC-FR3 ：GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO. 13)；
[0027] LC-FR4 ：FGGGTKVEIK (SEQ ID NO. 14)。
[0028] 本发明第二方面公开了一种抗Blys抗体，包含重链和轻链可变区，其重链可变区 和轻链可变区分别与前述重链和轻链可变区具有至少90%的整体序列同一性。
[0029] 优选的，所述至少90 %的整体序列同一性是指序列同一性为91 %，92 %，93 %， 94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%。
[0030] 进一步，所述抗体的重链可变区的3个互补决定区⑶R-Hl、⑶R-H2、⑶R-H3 其氨基酸序列分别与 TFGMN(SEQ ID NO. I)、YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ ID NO. 15)和 LGDPLLRPKGNAMD(SEQ ID NO. 3)具有至少90%的整体序列同一性；所述轻链可变区的3个 互补决定区 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3 其氨基酸序列分别与 LASQTIGTWLA(SEQ ID NO. 16)、 AATRKAD(SEQ ID NO. 17)和 QQLYSSPWT(SEQ ID NO. 6)具有至少 90%的整体序列同一性。
[0031] 优选的，所述抗Blys抗体包含如下氨基酸序列所示的重链和轻链可变区片段：
[0032] 重链可变区：
[0033] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTFGMNWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADTVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGDPLLRPKGNAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 18);轻链可变区：
[0034] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAATRKADGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO. 19)。
[0035] 进一步，所述抗Blys抗体还包括免疫球蛋白的恒定区。
[0036] 更优选的，所述抗Blys抗体，包含（a) -条重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 20 所示；(b) -条轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 21所示。
[0037] 进一步，所述抗BLYS抗体为单克隆抗体。
[0038] 进一步，所述抗BLYS抗体为IgG。
[0039] 优选的，所述抗BLYS抗体为人IgG。
[0040] 更优选的，所述抗BLYS抗体为IgGl。
[0041] 本发明第三方面公开了前述抗Blys抗体的重链和轻链，以及前述抗Blys抗体在 制备治疗Blys相关性疾病的药物中的用途。
[0042] 进一步，所述Blys相关性疾病为自身免疫性疾病（例如全身性自身免疫性疾病有 人类系统性红斑狼疮SLE、干燥综合征SS和类风湿关节炎RA)，感染性疾病（例如AIDS)，或 增殖性疾病（例如白血病，癌症和淋巴瘤）。
[0043] 本发明抗Blys抗体的重链和轻链，以及抗Blys抗体还可以用于与Blys相关的科 学研究，如发育生物学、细胞生物学、代谢、结构生物学、功能基因组学等多个领域的科学研 究、或肿瘤、全身性自身免疫性疾病有SLE、类风湿关节炎等医学和药学的应用研究。
[0044] 本发明最后一方面公开了一种药用组合物，含有有效量的前述抗Blys抗体。
[0045] 本发明所述抗Blys抗体可以为单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及 前述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何 多肽。
[0046] 进一步，所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体和/或稀释剂。
[0047] 本发明还可以是一种试剂、试剂盒或芯片，包含前述的抗Blys单克隆抗体。
[0048] 本发明还公开了采用抗Blys抗体来抑制Blys活性的方法，以及该抗体用于治疗 Blys相关性疾病或使用含有该抗体的试剂盒进行Blys相关诊断与检测。
[0049] 本发明的抗体可用基因工程技术制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可 用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法 扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表 达载体中。
[0050] -旦制得本发明的抗体分子，就可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任 何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法（例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过蛋白 A亲和色谱和其它柱色谱）、离