一株杨树根际解磷细菌Pseudomonas frederiksbergensis JW-SD2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株杨树根际解磷细菌Pseudomonas frederiksbergensisJW-SD2 及其应用。 技术背景
[0002] 杨树是中国最主要的造林树种之一，全国杨树林面积达700万公顷。磷是植物生 长发育所必须的三大营养元素之一，但由于磷在土壤中往往以不溶性的磷化合物存在，不 能供给植物直接吸收利用，成为了制约植物生长的限制性营养元素。杨树人工林多采用短 期轮伐的经营方式，频繁的收获进一步造成了杨树林地磷元素的缺乏和地力衰退。土壤缺 磷已经成为了影响杨树生长，阻碍杨树产业可持续发展的瓶颈问题。农林业上采用施用磷 肥来增加土壤肥力，但由于可溶性的磷酸根离子和土壤金属离子的迅速螯合，使得磷肥的 使用效率极低。加之磷肥的高额成本及施用过程存在破坏生态环境的风险，开发和利用新 型的磷肥替代产品成为了农林业发展迫切的要求。因此，以解磷细菌为代表的生物菌肥开 发和利用受到了人们的关注。
[0003] 解磷细菌是一类能够溶解不溶性磷化合物，增加土壤肥力，促进植物生长的土壤 细菌。解磷细菌在植物根际土壤中分布广泛，目前解磷细菌的开发和研究工作主要集中在 农业上，而关于解磷细菌在林木根际的筛选和应用研究相对较少。不同的解磷细菌所具有 的解磷能力也有所不同，分离高效的解磷细菌，挖掘土壤磷库资源，是解磷细菌研究的基 础。此外，弄清楚解磷细菌的解磷特性，研究其植物促生能力将为其开发和应用奠定基础。 而这些研究也将进一步为我国林业生产中急需解决土壤缺磷问题提供新的解决路径。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一株杨树 根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2,其具有较强的解磷能力，并能在复杂 的环境条件下发挥其解磷能力。本发明的另一目的是提供上述的杨树根际解磷细菌 P.frederiksbergensisJW-SD2在促进杨树苗木生长上的应用。
[0005] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] 一株杨树根际解磷细菌，其分类命名为Pseudomonasfrederiksbergensis JW-SD2,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2015350,保藏日期为： 2015年6月2日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。
[0007] 所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2在溶解难溶性无机磷酸 盐中的应用。
[0008] 所述的难溶性无机磷酸盐为磷酸钙。
[0009] 所述的环境条件因素包括温度，酸碱度，溶氧条件，盐离子浓度。
[0010] 所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2在促进杨树苗木生长中 的应用。
[0011] 解磷细菌P. frederiksbergensis JW-SD2分离自山东沂水杨树根际土壤（棕壤 土）。
[0012] JW-SD2的生物学特征：JW-SD2菌株接种于LB培养基，30°C培养3天后，菌落圆形， 黄色不透明，边缘整齐，表面湿润光滑（图1，A);显微镜观察发现，该菌株为棒状或短杆状， 具有一端生的一根或两根鞭毛（图1，B);该菌株为好氧性细菌（图1，C)。JW-SD2菌株接 种于NBRIP培养基，30°C培养5天，菌落圆形，黄色不透明，菌落中心薄而边缘厚，菌落外围 有明显的溶磷透明圈，直径为菌落直径的3倍（图2)。
[0013]JW-SD2 菌株 16SrDNA序列，见SEQIDNO. 1 所示。GenBank数据库BLAST序列 比对结果显不，该JW-SD2 与Pseudomonasfrederiksbergensis(KC934887. 1)具有 99% 的相似度。Biolog检定系统鉴定结果也表明JW-SD2为一株Pseudomonas菌株。结合形 态特征、Biolog检定系统鉴定和16SrDNA序列分析，JW-SD2菌株被鉴定为Pseudomonas frederiksbergensisJW-SD2。
[0014] 上述的杨树根际解磷细菌P. frederiksbergensis JW-SD2对难溶性磷酸盐有较 强的溶解能力，能够在较为复杂的环境条件下发挥其解磷能力。接种实验结果表明，接种 JW-SD2菌株的NL895杨树苗高、地径生长均显著强于对照处理，说明该JW-SD2菌株对杨树 苗木具有较好的促生作用。
[0015] 所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2的解磷方法：将 P.frederiksbergensisJW-SD2菌株在LB培养基活化，30°C，180r/min培养至菌体浓度为 10scfu?mL\取lmL发酵液5000Xg离心5min，收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，将菌体 重新悬浮于lmL灭菌生理盐水中，制备成种子液；按1 %接种量将JW-SD2菌种子液接入含 磷的NBRIP培养基，20-35°C，pH4-10,并向NBRIP培养基中添加质量百分比浓度0% -3. 0% 的NaCl，180r?min1进行震荡培养解磷48-96h。
[0016] 所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2的解磷方法，优选： 30°C，pH7,加入 1. 0%NaCl，180r?min1 进行震荡培养解磷 72h。
[0017] 有益效果：与现有技术相比，本发明的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensis JW-SD2的优势包括：对难溶性的无机磷酸盐磷酸三钙（Ca3(P04)2)具有较强的溶解能力； 能够在较大变化幅度的温度、酸碱度、溶氧条件、盐离子浓度条件下发挥其解磷能力；通过 盆栽杨树苗的接种试验，证明JW-SD2菌株能够显著的促进杨树苗的生长。因此，本发明的 P.frederiksbergensisJW-SD2能为开发微生物菌肥提供优良的菌株资源，具有良好的应 用开发潜力和前景。
【附图说明】
[0018] 图1是JW-SD2菌株的生物形态学特征图；其中，A图为JW-SD2菌株接种于LB培 养基，30°C培养3天后示意图，B图是显微镜观察发现图，C图为好氧性细菌图；
[0019] 图2是JW-SD2菌株在NBRIP培养基上的解磷情况结果图；
[0020] 图3是JW-SD2菌株在NBRIP液体培养基中解磷动力学结果图；
[0021 ] 图4是JW-SD2菌株在NBRIP液体培养基中的pH及可滴定酸度结果图；
[0022] 图5是JW-SD2菌株在不同温度条件下的解磷能力结果图；
[0023] 图6是JW-SD2菌株在不同初始pH下的解磷能力结果图；
[0024] 图7是JW-SD2菌株在不同装液量下的解磷能力结果图；
[0025] 图8是JW-SD2菌株在不同NaCl浓度下的解磷能力结果图；
[0026] 图9是JW-SD2菌株对NL895杨树苗（Populuseuramericanacv.)生长影响的结 果图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以使本领域 的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制 权利要求书中所详细描述的本发明。
[0028] 以下实例中，LB培养基的配方为：胰蛋白胨10. 0g，酵母粉5. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏 水1000mL，pH 7. 0,固体培养基添加1. 5g/100mL的琼脂。磷酸盐生长培养基（NBRIP)的 配方为：葡萄糖l〇g，Ca3(P04)2 5g，MgCl2. 6H20 5g，KC1 0? 2g，MgS04. 7H20 0? 25g，（NH4)2S04 〇. lg，蒸馏水lOOOmL，pH 7. 0,固体培养基添加1. 5g/100mL的琼脂。杨树根际解磷细菌 P. frederiksbergensis JW-SD2在不同环境条件下的解磷能力均在NBRIP培养基中进行， pH利用lmol *L iCl或NaOH进行调整，装液量实验在100mL三角瓶中进行，NaCl浓度实验 使用分析纯NaCl试剂。
[0029] 实施例1 JW-SD2菌株解磷试验
[0030] 将-80°C保存的P.frederiksbergensisJW-SD2菌株活化2次后，接种于LB培养 基，30°C，180r/min培养20h，发酵液菌体浓度为10scfu.mLi。取lmL发酵液5000Xg离心 5min，收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，将菌体重新悬浮于lmL灭菌生理盐水中，制备成种 子液。按1 %接种量将JW-SD2种子液接入NBRIP培养基，30°C，180r1进行震荡培养， 以不接菌处理作为空白对照，每隔24h对取3组重复进行采样测定，直到第192h。采用分光 光度计测定发酵液〇D_nm，比浊法测定细菌生长量。发酵液10000Xg离心15min，采用钼 锑抗比色法测定上清液可溶性含量，PB-10标准型PH计测定上清液pH，可滴定酸法测定上 清液可滴定酸度。
[0031] 结果如图3所示，JW-SD2菌株在72h之前具有较强的解磷能力，最高解磷量达 7. 75mmol吨\此后JW-SD2菌株解磷量总体呈现逐渐下降的趋势。细菌生长测定结果显示 JW-SD2菌株在48h时达到稳定期，96h后细菌数量出现