一种用于胚胎干细胞培养的组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞学领域，具体地，涉及一种用于胚胎干细胞培养的组合物及其应 用。
【背景技术】
[0002] 人类胚胎干细胞的成功分离培养建系是当今生命科学的重要进展，它是从人类早 期植入前胚胎的内细胞团中分离而来的、能在体外适当条件下保持不分化并不断增殖的一 种干细胞。理论上，它具有分化成机体所有细胞组织的潜能，被称为"种子细胞"。人们可以 利用不同的培养条件将胚胎干细胞定向诱导分化产生大量不同类型的细胞来作为细胞移 植、组织替代甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多的难治性疾病提供无限的细 胞来源。因此在将来的医学临床应用中前景广阔，成为21世纪生命科学中又一研究热点。 此外，人胚胎细胞还有诸多其他用途，比如，其作为基因治疗的载体，通过同源重组方式进 行基因剔除或转基因将修饰基因导入到干细胞中，可达到基因治疗的目的；它可提供任何 组织类型的正常人类细胞，为开发新药提供大量标本，而且可用于筛选药物、鉴定新药作用 的靶基因位点、筛选用于组织再生基因治疗的基因。哺乳动物的胚胎干细胞则是生物医学 研究中的重要工具和模型。高效的胚胎干细胞培养系统将促进基于干细胞的再生生物医学 的研究和临床治疗。
[0003] 胚胎干细胞的培养需要注意以下两点：一、确保胚胎干细胞处于未分化状态；二、 确保胚胎干细胞具有无限增殖的能力。
[0004] 现有的文南犬l:XueFetal,Recombinantrabbitleukemiainhibitoryfactor andrabbitembryonicfibroblastssupportthederivationandmaintenanceof rabbitembryonicstemcells.CellReprogram. 2012 ;14(4):364_76 (薛非等，重组兔 白血病抑制因子和兔胎儿成纤维细胞支持兔胚胎干细胞的获取与维持。CellReprogram. 2012: 14(4) :364-76)。其公开的家兔胚胎干细胞培养液包括下述组分：
我们在上述细胞培养液的基础上添加了GSK/3信号通路抑制剂CHIR99021和MEK抑制 剂ro〇325901，发现虽然家兔胚胎干细胞能够在该培养基中可以短暂形成干细胞克隆，但是 不能长期地维持胚胎干细胞的特性。这些细胞克隆短暂显示胚胎干细胞的特性，但在体外 的条件下，很快分化为成纤维样的细胞群体。
[0005] 我们发现在添加白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF)、碱性成纤 维细胞生长因子（basicFibroblastGrowthFactor，bFGF)、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形 态发生蛋白抑制剂Noggin的基础培养液中，胚胎干细胞能够长期处于未分化状态并具有 无限增殖的能力。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于胚胎干细胞培养的组合物，其能确保胚 胎干细胞长期处于未分化状态并具有无限增殖的能力。
[0007] 本发明另一个要解决的技术问题是提供一种包含该组合物并能够适用于胚胎干 细胞培养的细胞培养液。
[0008] 本发明又一个要解决的技术问题是提供该培养液在哺乳动物胚胎干细胞中的应 用。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明的一种用于胚胎干细胞培养的组合物，其包括白血 病抑制因子（LIF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生 蛋白抑制剂Noggin。
[0010] 进一步地，该组合中白血病抑制因子（LIF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、 Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin配比为（1yg~80yg) : (1yg~ 200yg):(ltimol~lOOumol) :(10iig~1000yg)〇
[0011] 为解决上述技术问题，本发明的包含该组合物的一种细胞培养液，其包括 基础培养液 1000ml/L; 白血病抑制因子 1yg/L~80yg/L; 碱性成纤维细胞生长因子 1yg/L~200yg/L; Rho激酶抑制剂Y27632 1ymol/L~100ymol/L; 骨形态发生蛋白抑制剂Noggin 10yg/L~1000yg/L。
[0012] 进一步地，所述基础培养液包括 KnockoutDMEM培养液 800ml/L; 胎牛血清 200ml/L; 非必需氨基酸 0. 1mmol/L; 0疏基乙醇 0? 1mmol/L; 谷氨酰胺 4mmol/L; 青霉素 50000U/L; 链霉素 50mg/L。
[0013] 更进一步地，所述碱性成纤维细胞生长因子浓度为10yg/L~200yg/L。
[0014] 更进一步地，所述白血病抑制因子浓度为10yg/L~80yg/L。
[0015] 更进一步地，所述Rho激酶抑制剂Y27632浓度为5yM~40yM。
[0016] 更进一步地，所述骨形态发生蛋白抑制剂Noggin浓度为100yg/L~800yg/ L〇
[0017] 更进一步地，所述基础培养液中KnockoutDMEM培养液可由DMEM培养液替代，我 们发现还有上述四个因子的细胞培养液，其基础培养液采用DMEM培养液也能达到类似的 效果。
[0018] 本发明的上述细胞培养液在胚胎干细胞培养中的应用。
[0019] 进一步地，所述胚胎干细胞选自小鼠胚胎干细胞或家兔胚胎干细胞或人胚胎干细 胞。
[0020] 经实验证明，家兔胚胎干细胞在包含白血病抑制因子LIF、碱性成纤维细胞生长因 子bFGF、Rho激酶抑制剂Y27632、骨形态发生蛋白抑制剂Noggin四个因子的细胞培养液中 生长得到显著改善，多能性表达增强，并能在体外试验条件下分化为不同的胚层，表达该胚 层的特异分子标记、特异基因，并在囊胚注射后可形成嵌合体动物；即胚胎干细胞在该培养 体系中能够处于未分化状态并具有无限增殖的能力。同时，含有上述4个因子组合物的细 胞培养液同样适用于小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞的培养。具体地，LIF促进LIF/STAT3 的信号通路；bFGF促进FGF/MEK/ERK的信号通路，LIF/STAT3和FGF/MEK/ERK信号通路开 通可以确保胚胎干细胞的诱导与维持。Y27632抑制Rho激酶通路，从而防止细胞的凋亡 (programmedcelldeath)。Noggin则是BMP/Smad信号通路的抑制剂，BMP/Smad信号通 路的开通，会阻止胚胎干细胞的形成与维持，同时促进干细胞的快速分化。Noggin能够有效 地抑制BMP/Smad信号通路，从而防止细胞的分化，促进胚胎干细胞的维持。
【附图说明】
[0021] 图1A为家兔胚胎干细胞在bFGF添加和无bFGF添加的培养基中培养的显微图像。 在有10ng/mLbFGF添加的培养基中，细胞生长呈现出明显的家兔胚胎干细胞的特性，细胞 之间的接触致密，细胞形态规则整齐，细胞成克隆生长状态。在无bFGF添加的培养基中细 胞迅速分化，出现成纤维类型的形态与生长模式。
[0022] 图1B为家兔胚胎干细胞在添加不同浓度的bFGF的培养条件下的细胞生长比例 分布图。在添加了 5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，100ng/ml和 200ng/mlbFGF标准培养液的滋养细胞层上接种lOxlO4的干细胞。扩增三代后的结果显示在40 ng/mL及更高的浓度时，干细胞显示出相似的细胞动力学特性。合适的bFGF浓度为40-200 ng/mL〇
[0023] 图1C为家兔胚胎干细胞在不同浓度的LIF的细胞生长曲线图。用在添加了 0,10 ng/ml，20ng/ml，40ng/ml和80ng/mlLIF的滋养细胞层上接种lOxlO4干细胞。在对照组 中加入l〇ng/ml的市销LIF(Millipore,USA)，在20ng/ml及以上浓度，用rbLIF培养的干 细胞显示出和对照组相似的细胞动力学特性。合适的LIF浓度为10ng/mL~80ng/mL。
[0024] 图ID为家兔胚胎在添加了LIF、CHIR99021和ro〇325901的培养基中培养的显微 图像。D0天，兔胚泡被接种到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上；D2天，捕捉到假定的基态细胞 群；D4天，细胞开始死亡。
[0025] 图1E为家兔胚胎干细胞细胞系M5、2-4在添加不同浓度的Y27632的FL培养体系 下的细胞生长数量曲线图。Y27632浓度在5yM~40yM较为适宜。图示中出现不同的 a,b,c,d标识说明，处理组中的细胞数目存在显著差异（p〈0. 05);处理组b和be,cd 和d，be和cd之间只要出现重叠的字母，说明处理组中细胞数目没有差异（p>0. 05)。
[0026] 图IF上两排为家兔胚胎干细胞细胞系M5添加0到