一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，具体是涉及一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干 细胞的生产方法。
【背景技术】
[0002] 常规分离方法通常难以获得大量纯度较高的滋养细胞和胎盘间充质干细胞；应用 流式细胞仪分选法或磁珠分选法获得的细胞虽然纯度好，但成本很高。
[0003] 滋养细胞在体外培养和传代比较困难，很多研究者都采用分离细胞后直接处理或 干预的方案，因此一次性获得大量的滋养细胞对实验进行是非常有利的。胎盘间充质干细 胞在胎盘组织的丰度低，想获得一定数量的原代细胞也需要很多的胎盘组织。
[0004] 现有技术中，胎盘的细胞成分较复杂，其中所包含的滋养细胞在母胎免疫耐受过 程中起重要作用，胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性，常 规离方法通常难以获得大量且纯度较高的上述两种细胞。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提供一种人胚胎滋养细胞和 胎盘间充质干细胞的生产方法，可以达到一次操作即可同时获得大量、较高纯度的人胚胎 滋养细胞和胎盘间充质干细胞的目的。
[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案为：
[0007] -种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的生产方法，包括以下步骤：
[0008] (1)胎盘标本处理：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2.0~ 3. 0_组织后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的 保存液是将10~100yg/ml多聚赖氨酸加入到10~100yg/ml没食子酸酯EGCG中配制 而成，浸泡预定时间后，将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至 冲洗液接近无色，得处理后的胎盘组织；
[0009] (2)组织消化：用15mmol/L三羟甲基氨基甲烧，加入哈特曼-D溶液，调节pH至 8. 0,作为消化缓冲液，加入终浓度为2. 4g/LHyQTase(购于HyClone公司）和300U/mL DNaseI组成的消化液，取消化液320mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在 37±0. 2°C、180r/min恒温气浴摇床消化2min，消化完毕后，无菌去除HyQTase溶液，用新生 牛血清终止消化反应，得到细胞悬液；
[0010] (3)密度梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液， 每个密度5mL，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min，小心弃 除离心管20mL刻度以上的液体，收集12. 5~20.OmL刻度的细胞层和12. 5~7. 5mL刻度 的液体，在离心管15~20mL刻度处可见明显的白色云雾状细胞层，此处对应的Percoll相 对密度为1. 046~1. 059,是滋养细胞存在的区域；离心管10mL刻度附近可见不明显的细 胞层，此处密度为1. 072,是淋巴细胞和胎盘间充质干细胞存在的区域，分别放入不同离心 管里，用D-Hank's液稀释5倍后，室温下lOOOg离心15min;离心管底可见白色细胞团得梯 度密度分离后的滋养细胞和胎盘间充质干细胞；
[0011] ⑷滋养细胞的获得：用含体积分数为10%胎牛血清（FBS)的DMEM/F12、丙酮酸 盐、10mg/L亚硒酸钠胰岛素、2mg/L乙醇胺和20毫yg/mL的bFGF配制成悬浮液，将密度梯 度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞，获得滋养细胞；经计数，获 得的滋养细胞量可达（5. 48±1. 98)X108个；
[0012] (5)胎盘间充质干细胞的培养：用含体积分数为10 %胎牛血清（FBS)的DMEM/ F12、丙酮酸盐、10mg/L亚硒酸钠胰岛素、2mg/L乙醇胺和20毫yg/mL的bFGF、增殖促进 剂配制成悬浮液，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在微重力环境下， 依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞；计数并接种于75mm的培养瓶，在培养基中补充 4mg/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、10ng/mlN-乙酰基-L-半胱氨酸、100ng/ml氯化 钙，放入37°C、二氧化碳浓度为0. 5 %的C02培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90 % 融合后，消化并计数细胞，按1 : 4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均 一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理， 第5天用lng/ml的BMP4处理，传至第8代时细胞开始出现老化现象，细胞增殖缓慢，细胞 体积增大，胞浆中出现很多黑色颗粒，此时需要注入一种抗氧化剂，所述抗氧化剂为聚乙二 醇-缀合过氧化氢酶（PEG-过氧化氢酶）或N-乙酰半胱氨酸，或使用抗氧化物，所述抗氧 化物为l-500yM丙酮酸乙酯（EP)，抑制间充质干细胞的衰老，用于增加干细胞产量，直到 传至第九或十代。
[0013] 进一步地，所述增殖促进剂为凝结的脐带血液的液体成分，以促进细胞生长。
[0014] 进一步地，所述微重力环境是通过多轴旋转所形成的模拟微重力环境，可以获得 具有更小的平均气泡尺寸的间充质干细胞。
[0015] 本发明的有益效果是：
[0016] (1)本发明采用HyQTase和DNAseI共同消化组织，经梯度密度分离后，可同时一 次性获得大量的滋养细胞和较多的胎盘间充质干细胞，对细胞损伤小，所获得细胞纯度和 活力都比较理想；
[0017] (2)使用不连续梯度的Percoll细胞分离液可以去除消化碎片、成纤维细胞和红 细胞，并把滋养细胞和胎盘间充质干细胞区分开来；获得的细胞滋养细胞在经差速贴壁法 贴除成纤维细胞后，纯度可达90 %，而且成本较低。
[0018] (3)密度梯度分离后获得的胎盘间充质干细胞在培微重力环境下，依次通过电磁 场和声波处理间充质干细胞，并注入一种抗氧化剂，一直可以传代至第九或十代。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例中各个浓度Percoll分布位置、相对密度和对应的细胞种类 图；
[0020] 图2为本发明实施例中梯度密度分离后接种培养的胎盘间充质干细胞生长形态 (X100)图，A:第四代，B:第八代，C:第九代，D:第十代；
[0021] 图3为本发明实施例中胎盘间充质干细胞的成骨分化潜能（X100)图，A:诱导实 验组，B:对照组。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实验室进行的具体试验对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发 明不限于以下列举的特定例子。
[0023] -种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的生产方法，包括以下步骤：
[0024] (1)胎盘标本处理：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2. 0mm组织 后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将 10yg/ml多聚赖氨酸加入到10yg/ml没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，将剪 下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色，得处理后的 胎盘组织；
[0025] ⑵组织消化：用15mmol/L三羟甲基氨基甲烧，加入哈特曼-D溶液，调节pH至 8. 0,作为消化缓冲液，加入终浓度为2. 4g/LHyQTase(购于HyClone公司）和300U/mL DNaseI组成的消化液，取消化液320mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在 36. 8°C、180r/min恒温气浴摇床消化2min，消化完毕后，无菌去除HyQTase溶液，用新生牛 血清终止消化反应，得到细胞悬液；
[0026] (3)密度梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液， 每个密度5mL，如表1所示，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心 20min，小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12. 5~20.OmL刻度的细胞层和12. 5~ 7. 5mL刻度的液体，在离心管15~20mL刻度处可见明显的白色云雾状细胞层，此处对应的 Percoll相对密度为1. 046~1. 059,是滋养细胞存在的区域；离心管10mL刻度附近可见不 明显的细胞层，此处密度为1.072,是淋巴细胞和胎盘间充质干细胞存在的区域，见图1，分 别放入不同离心管里，用D-Hank's液稀释5倍后，室温下1000g离心15min;离心管底可 见白色细胞团得梯度密度分离后的滋养细胞和胎盘间充质干细胞；
[0027]
[0028] (4)滋养