重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于狒狒尿酸酶进行改造后与人体高度同源且生物学活性很高的尿酸酶嵌合蛋白及其作为制备治疗痛风或者高尿酸血症的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]痛风和高尿酸血症是目前危害人类健康的常见疾病，据统计高尿酸血症的发病率已经达到了人群的10%。痛风是由于血尿酸水平过高而造成尿酸盐结晶在关节中沉积而导致的一种急性关节炎。尿酸是人体在代谢嘌呤过程中的产物，嘌呤代谢障碍会导致尿酸积累过量，引起血液中尿酸浓度增高，引发高尿酸症。长期尿酸过高极易引发痛风，并增加多种心脑血管疾病的发病风险，包括动脉粥样硬化、高血压、脑卒、糖尿病等。此外，恶性肿瘤的患者在化疗过程中，大量细胞的死亡溶解会带来肿瘤溶解综合症TLS，最主要的症状就是高尿酸血症，并极易引发肾衰竭。
[0003]目前，控制痛风和治疗尿酸过高的药物都有诸多缺陷。秋水仙碱可以抑制痛风发作时的急性炎症反应，但是毒性巨大，且不能降低尿酸含量。丙磺舒、苯溴马隆等药物可以干扰肾小管对尿酸的重吸收，促进尿酸的排泄，但是对人体肾脏的损伤巨大，容易引发肾结石等肾病的发生。吲哚美辛等非留体抗炎药可以缓解改善痛风引发的关节炎等症状，消除疼痛，但是无法长期服用，副作用巨大。别嘌呤醇等药物通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，阻断尿酸的产生来降低尿酸，但是又增加了肾脏排泄尿酸前体的负荷，而且容易引发黄嘌呤肾病和结石。目前，高尿酸血症已被列为心血管疾病的独立风险因素。因此，寻找有效的治疗手段势在必行。
[0004]在动物体内，其尿酸的水平仅为人类的1/10。因此痛风和高尿酸血症也被认为是人类独有的疾病。动物体内尿酸水平低的原因是由于其体内存在有能够把尿酸进一步分解为极易溶解的尿囊素的尿酸酶。通过对比发现，人类的基因组中也存在尿酸酶基因，但是在人类进化的过程中，由于该基因的突变，造成其不能表达有功能的蛋白质，从而成为一个假基因。由此可见尿酸酶是治疗痛风与高尿酸血症的理想药物。与上述药物相比，尿酸氧化酶UOX针对的直接药物靶点就是尿酸，能够快速降低人体血液中的尿酸浓度，而且还能催化肾脏和关节中的尿酸沉淀快速分解，能从根本上治疗高尿酸血症，副作用极低。
[0005]尿酸氧化酶UOX是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，能高效氧化尿酸成为尿囊素和过氧化氢。UOX分子是同源四聚体，每个蛋白亚基含有301个氨基酸，单亚基分子量为34kDa。UOX的每个亚基由两个相同的结构域组成，被称为T-折叠结构域。UOX的4个亚基通过复杂的氢键网络形成非共价连接，组成对称的四聚体蛋白。只有四聚体的UOX才具有生物酶活性。在目前所知的所有来源的尿酸酶中，活性最高的来源于黄曲霉，达到27IU/mg ;其次是来源于苛求芽胞杆菌，它的活性保持在13 IU/mg。；来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达以后，猪的尿酸酶活性可以达到5IU/mg，狒狒的尿酸酶酶活性只有IIU/mg,而人源尿酸酶无活性。
[0006]要想将尿酸酶应用于人体，需要兼顾微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性才行。目前，黄曲霉来源的尿酸酶(Uricozyme)在法国和意大利已批准，但其序列与推测出的人源尿酸酶的同源性不足40% ;基因重组的酵母菌尿酸酶(Rasburicase)在美国和欧盟或批准。由于这两种尿酸酶均来自于细菌，有很强的免疫原性，Uricozyme和Rasburicase在使用中出现严重过敏反应的比例达5%以上，并且还有近半数的患者出现发热，恶心呕吐等不良反应。目前在美国用于临床的尿酸酶蛋白(Pegloticase)是经过PEG化修饰的猪的重组尿酸酶嵌合蛋白，商品名为KRYSTEXXA。但由于与人类的差异造成的排异反应，加之PEG化的影响，其免疫原性仍然较强。每两周一次静脉注射KRYSTEXXA的患者中92%产生了抗pegloticase的抗体。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是进一步改善重组尿酸酶的免疫原性，选择与人类更为接近的狒狒作为尿酸酶基因的来源，并且基于结构生物学和蛋白酶学的方法，对其进行了提高酶活的突变改造，从而获得了与人体尿酸酶高度同源但是具有高酶活的人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白，对于痛风和高尿酸症的防治具有重要的应用价值。本发明包括此新型嵌合尿酸酶JBUO的优化基因序列，蛋白质序列，重组表达载体的构建方法，嵌合尿酸酶的提纯工艺，性质鉴定和活性标定等。
[0008]本发明是采用如下技术方案实现的:
一、重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO的序列设计
狒狒体内的尿酸酶(Pap1 hamadryas Urate Oxidase，简写为PU0)与推测出人体的尿酸酶(predicted Human Urate Oxidase，简写为pHUO)序列高度相似，同一性为95.4%，远高于猪源的尿酸酶(86.6%)，鼠源的尿酸酶(85.2%) (Rattus norvegicus Urate Oxidase,简写为 RU0)和犬源的尿酸酶(88.2%) (Canis lupus familiaris Urate Oxidase，简写为CU0)。因此，本申请人基于狒狒尿酸酶PUO进行突变改造，可以极大程度的降低人体中重组蛋白的免疫原性。然而，狒狒体内的尿酸酶活性不高(约?υ/mg)，比其它哺乳动物来源的尿酸酶都低(猪尿酸酶5 U/mg，犬尿酸酶7 U/ml)。因此，如何通过替换提高酶催化活性的尿酸酶氨基酸序列，显著提高狒狒尿酸酶PUO的催化活性，就是本发明的主要目的。
[0009]本发明人经过长期系统的研究，特别是结合尿酸酶四聚体复合物的晶体结构进行分析，发现进行特定位点的氨基酸替换，可以形成特定形式的重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBU0，其氨基酸序列如下:
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPffKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMKSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKffRYHQGRDVDFEATffDTVRDIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRLο
[0010]该重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO与人源尿酸酶pHUO氨基酸序列相似性很高(94.8%)，而且活性显著提升(大于6U/mg)，同时兼顾了免疫原性低和活性高两大难题，具有极其重要的应用价值。
[0011]进一步的，JBUO的序列来自于狒狒尿酸酶PUO序列，由304个氨基酸组成。如图I所示，与天然的PUO相比，突变位点包括以下12个:D3H，N7D，G91A，V92M，Y97H，I105V，L120F，L146M，R147K，C202G，G212D，E220K。其中部分位点的突变是为了增强尿酸酶催化活性，其它位点的突变是为了进一步减少免疫原性。
[0012]二、重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO的重组表达
重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白对应的核苷酸序列插入原核表达载体或者真核表达载体进行表达。优选的，将该蛋白对应的核苷酸序列插入大肠杆菌表达载体进行表达，用ρΗΙΟ-11的碱性缓冲液溶解蛋白进行快速纯化。
[0013]根据JBUO的氨基酸序列和大肠杆菌的偏好密码子表，设计利于重组表达的JBUO基因，其核苷酸序列如序列表I所示；克隆得到JBUO基因片段克隆进入大肠杆菌高效表达载体。JBUO表达载体转化大肠杆菌，然后诱导重组基因高效表达，可以得到富含JBUO蛋白的菌体。
[0014]用PH7.5的中性缓冲溶液重悬菌体，超声破碎，高速离心收集沉淀部分。然后用PHll的碱性缓冲溶液溶解沉淀，再次高速离心收集上清，即得到了 JBUO蛋白的高浓度溶液，可以直接用于精细纯化、活性检测或其它用途。
[0015]将含有JBUO蛋白的溶液可以进一步进行纯化处理，包括离子交换纯化和分子筛纯化，得到高纯度的JBUO蛋白，可以进行含量测定和活性检测，或冻干备用。
[0016]本发明中所述的高效表达载体可以采用本领域中常用的多种表达载体，包括但不限于 pET-21，pET-26，pET-28 等等。
[0017]本发明中所述的纯化方法可以采用本领域中常规使用的多种手段进行，例如亲和层析、离子交换等等。
[0018]三、重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO的活性测定
JBUO及其它对照尿酸酶均采用国际通用的酶活标定方法测试活性。尿酸在检测波长292nM下有特征的吸收峰，尿酸氧化酶氧化尿酸为尿囊素，而氧化产物尿囊素的吸收最大值不在292nM。所以在一定范围内尿酸A292nM吸收值与其浓度成正比，所以尿酸在尿酸氧化酶的作用下吸收值的降低可反映酶活性高低。反应前按照I μM到500 μM的浓度范围，测定尿酸溶液的Α292ηΜ标准曲线。反应缓冲溶液为三乙醇胺盐酸缓冲液，ρΗ8.9。检测时，尿酸浓度为100 μΜ，3ηι1的反应体系中加入总量为50 μ g的蛋白酶，然后在30°C条件下反应5min，然后用IM KOH终止反应，测定292nM下的吸光度。尿酸氧化酶的活性定义为，在标准条件下30°C时，每分钟催化I μπιο?尿酸氧化所需的酶量为I个国际单位IU。
[0019]如图4所示，实验测得，狒狒HJO的酶活为1.9 U/mg,犬⑶O的酶活为5.2 U/mg,与文献报道基本一致，而JBUO的测定的酶活为6.0 U/mg,显著高于原有狒狒PUO的酶活。
[0020]本发明设计合理，提供了一种全新的有高活性的人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBU0，适合作为治疗高尿酸血症等相关疾病的药物。所公开的重组人/狒狒嵌合尿酸酶JBU0，既保留了狒狒尿酸酶中与人源预测尿酸酶高度同源性的部分，降低了免疫原性，又通过点突变的方法，显著提高了酶活，整个制备工艺简单，产品可作为药物或保健用品，广泛用于高尿酸相关病症的治疗，利用向市场广泛推