微生物絮凝剂协同活性炭固定絮凝沉降油脂酵母的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着石油资源的日益紧缺，多渠道开发可再生油脂资源成为必然。微生物油脂又 称单细胞油脂，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、 碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂。利用微生物生产油脂，微生 物细胞增殖快，生产周期短；微生物生长所需的原料丰富，价格便宜；用微生物方法生产油 月旨，不受季节、气候变化的限制，能连续大规模生产，生产成本低。斯达氏油脂酵母能在细胞 内合成大量的油脂，是一种高效的产油微生物。工业上常用斯达氏油脂酵母进行微生物油 脂的制备。
[0003] 然而目前微生物油脂制备上的主要瓶颈就是工业生产中产油微生物菌体积累油 脂后从发酵液中分离、获得的工艺复杂，成本高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是对活性炭进行处理后成为载体，用于固定斯达氏油脂酵母，便于 后续微生物絮凝剂对其进行絮凝沉降的微生物絮凝剂协同活性炭固定絮凝沉降油脂酵母 的方法。
[0005] 本发明的步骤是： (1) 活性炭的处理 取活性炭，在200°C下干燥2h;冷却至室温后，按活性炭和水的体积比为1:3称取活性 炭和水；将活性炭和水搅拌均匀后，加入浓度为38%硫酸；水浴温度80°C条件下充分搅拌2 h;之后抽滤，用除盐水对活性炭进行多次洗涤，至滤液pH值呈中性；将过滤后的活性炭在 200°C下烘干；取出活性炭置于300°C马弗炉中烘烤2. 5h后置于干燥器中备用； (2) 酱油曲霉制备微生物絮凝剂 将保存在斜面上的菌株编号为CGMCCNO:3. 5231的酱油曲霉接入到无菌的发酵培养 基中，所述的酱油曲霉发酵培养基中各组分用量分别为：葡萄糖；NaN03;MgS04 ? 7H20 ;KC1 ; FeS04;KH2P04;pH=6. 0 ;在30°C摇床上以180rpm培养3天，得到高絮凝活性的微生物絮凝 剂；冷却至室温后，将微生物絮凝剂存放在4°C冰箱中保存备用； (3) 斯达氏油脂酵母培养液的制备 将保存在斜面上的菌株编号为CGMCCNO:2. 1560的斯达氏油脂酵母接入到无菌的种 子培养基中，所述的斯达氏油脂酵母种子培养基中各组分用量分别为：葡萄糖；（NH4)2S04; 酵母粉；KH2P04;MgS0 4 ? 7H20 ;pH=6. 0 ;在22°C摇床上以150rpm培养1天，得到培养好的斯 达氏油脂酵母菌悬液，将得到的菌悬液存放在4°C冰箱中保存备用； (4) 活性炭对菌株编号为CGMCCNO:2. 1560的斯达氏油脂酵母的固定化 取步骤（3)得到的斯达氏油脂酵母菌悬液，投入到无菌的限氮培养基中，所述的限氮培 养基中各组分用量分别为：葡萄糖；（NH4)2S04j#母粉；KH2P04;MgS0 4 *7H20 ;pH=6. 5 ;取步骤 (1)得到的活性炭，加入到上述已经接入斯达氏油脂酵母的限氮培养基中，在22°C摇床上以 150rpm培养3天，得到活性炭固定化的斯达氏油脂酵母菌悬液； (5)微生物絮凝剂絮凝沉降活性炭固定化的菌株编号为CGMCCNO:2. 1560的斯达氏 油脂酵母，取步骤（2)得到的微生物絮凝剂，投入到步骤（4)得到的活性炭固定化的斯达氏 油脂酵母菌悬液中，用混凝搅拌器以300rpm快速搅拌1min，然后以30rpm慢速搅拌3 min，然后静置5min，静置时每隔1min取上清液，用分光光度计在600nm处测定其吸光 度，计算絮凝沉降率，实现微生物絮凝剂絮凝沉降活性炭固定化的斯达氏油脂酵母。
[0006] 本发明对活性炭进行处理，使其成为固定化油脂酵母的优良载体，进而用于固定 斯达氏油脂酵母，增大斯达氏油脂酵母的粒径，便于后续微生物絮凝剂对其进行絮凝沉降； 然后利用酱油曲霉制备微生物絮凝剂；最后利用酱油曲霉制备的微生物絮凝剂对活性炭固 定化的斯达氏油脂酵母进行絮凝沉降，使斯达氏油脂酵母从发酵液中分离出来。其积极效 果是： 1、 微生物絮凝剂和活性炭无毒无害，对微生物油脂的后续利用不产生影响； 2、 活性炭固定化斯达氏油脂酵母，能有效增大斯达氏油脂酵母的粒径，利于后续微生 物絮凝剂对其进行絮凝沉降； 3、 微生物絮凝剂能高效絮凝沉降活性炭固定化的斯达氏油脂酵母，操作简单，絮凝沉 降时间短，斯达氏油脂酵母的絮凝沉降率高； 4、 斯达氏油脂酵母的絮凝沉降率保持在93. 90%~99. 62%。
【具体实施方式】
[0007] 本发明的步骤是： (1) 活性炭的处理 取活性炭，在200°C下干燥2h;冷却至室温后，按活性炭和水的体积比为1:3称取活性 炭和水；将活性炭和水搅拌均匀后，加入浓度为38%硫酸；水浴温度80°C条件下充分搅拌2 h;之后抽滤，用除盐水对活性炭进行多次洗涤，至滤液pH值呈中性；将过滤后的活性炭在 200°C下烘干；取出活性炭置于300°C马弗炉中烘烤2. 5h后置于干燥器中备用； (2) 酱油曲霉制备微生物絮凝剂 将保存在斜面上的菌株编号为CGMCCNO:3. 5231的酱油曲霉接入到无菌的发酵培养 基中，所述的酱油曲霉发酵培养基中各组分用量分别为：葡萄糖；NaN03;MgS04 ? 7H20 ;KC1 ; FeS04;KH2P04;pH=6. 0 ;在30°C摇床上以180rpm培养3天，得到高絮凝活性的微生物絮凝 剂；冷却至室温后，将微生物絮凝剂存放在4°C冰箱中保存备用； (3) 斯达氏油脂酵母培养液的制备 将保存在斜面上的菌株编号为CGMCCNO:2. 1560的斯达氏油脂酵母接入到无菌的种 子培养基中，所述的斯达氏油脂酵母种子培养基中各组分用量分别为：葡萄糖；（NH4)2S04; 酵母粉；KH2P04;MgS0 4 ? 7H20 ;pH=6. 0 ;在22°C摇床上以150rpm培养1天，得到培养好的斯 达氏油脂酵母菌悬液，将得到的菌悬液存放在4°C冰箱中保存备用； (4) 活性炭对菌株编号为CGMCCNO:2. 1560的斯达氏油脂酵母的固定化 取步骤（3)得到的斯达氏油脂酵母菌悬液，投入到无菌的限氮培养基中，所述的限氮培 养基中各组分用量分别为：葡萄糖；（NH4)2S04j#母粉；KH 2P04;MgS0 4 *7H20 ;pH=6.5 ;取步骤 (1)得到的活性炭，加入到上述已经接入斯达氏油脂酵母的限氮培养基中，在22°C摇床上以 150rpm培养3天，得到活性炭固定化的斯达氏油脂酵母菌悬液； (5)微生物絮凝剂絮凝沉降活性炭固定化的菌株编号为CGMCCNO:2. 1560的斯达氏 油脂酵母，取步骤（2)得到的微生物絮凝剂，投入到步骤（4)得到的活性炭固定化的斯达氏 油脂酵母菌悬液中，用混凝搅拌器以300rpm快速搅拌1min，然后以30rpm慢速搅拌3 min，然后静置5min，静置时每隔1min取上清液，用分光光度计在600nm处测定其吸光 度，计算絮凝沉降率，实现微生物絮凝剂絮凝沉降活性炭固定化的斯达氏油脂酵母。
[0008] 实施例1: (1) 活性炭的处理 取20g规格为300目的活性炭，在200°C下干燥2h;冷却至室温后，按活性炭和水的 体积比为1:3称取活性炭和水；将活性炭和水搅拌均匀后，加入浓度为38%硫酸；水浴温度 80°C条件下充分搅拌2h;之后抽滤，用除盐水对活性炭进行多次洗涤，至滤液pH值呈中 性；将过滤后的活性炭在200°C下烘干；取出活性炭置于300°C马弗炉中烘烤2. 5h后置于 干燥器中备用； (2) 酱油曲霉制备微生物絮凝剂 将保存在斜面上的菌株编号为CGMCCNO:3. 5231的酱油曲霉（Aspergillussojae)接 入到100mL无菌的发酵培养基中，所述的酱油曲霉发酵培养基中各组分用量分别为：葡萄 糖 25. 0g/L;NaN03 2. 0g/L;MgS04 ? 7H20 0? 2g/L;KC1 0? 3g/L;FeS04 0? 01g/L;KH2P04 0. 8g/L;pH=6. 0 ;在30°C摇床上以180rpm培养3天，得到高絮凝活性的微生物絮凝剂；7令 却至室温后，将微生物絮凝剂存放在4°C冰箱中保存备用； (3) 斯达氏油脂酵母培养液的制备 将保存在斜面上的菌株编号为CGMCCN0:2. 1560的斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi)接入到100mL无菌的种子培养基中，所述的斯达氏油脂酵母种子培养基中各 组分用量分别为：葡萄糖 15. 0g/L ;(NH4)2S047 . 0g/L ;酵母粉 0.8 g/L;KH2P04 0 .8 g/L ; MgS04*7H20 0.8 g/L;pH=6. 0;在22°C摇床上以150rpm培养1天，得到培养好的斯达氏油 脂酵母菌悬液，将得到的菌悬液存放在4°C冰箱中保存备用； (4) 活性炭对菌株编号为CGMCCNO:2. 1560的斯达氏油脂酵母的固定化 取10 mL步骤（3)得到的斯达氏油脂酵母菌悬液，投入到100 mL无菌的限氮培养基中， 所述的限氮培养基中各组分用量分别为：葡萄糖80. 0 g/L ; (NH4)2S04 1. 0 g/L ;酵母粉0.8 g/L;KH2P04 1.0 g/L;MgS04.7H20 1.0 g/L;pH=6.5;取 2g步骤（1)得到的活性炭，加入 到上述100 mL已经接入斯达氏油脂酵母的限氮培养基中，在22°C摇床上以150 rpm培养3 天，得到活性炭固定化的斯达氏油脂酵母菌悬液； (5) 微生物絮凝剂絮凝沉降活性炭固定化的菌株编号为CGMCCNO:2. 1560的斯达氏 油脂酵母 取0.5mL步骤（2)得到的微生物絮凝剂，投入到100mL步骤（4)得到的活性炭固定化 的斯达氏油脂酵母菌悬液中，用混凝搅拌