肝内胆管细胞癌相关的基因突变靶点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及肝内胆管细胞癌相关的基因突变 靶点，及其这些基因突变靶点在诊断或治疗肝内胆管细胞癌、评估肝内胆管细胞癌预后的 试剂或试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌（肝癌）是危害人类健康的主要疾病之一，目前全世界每10万人的发 病率约为0.85,且在过去30年内的增长率为165%。包括中国在内的亚洲人的肝癌发病率 是全世界最高的，约56%肝癌发生在中国，其10万人的发病率和增长率都远高于世界平均 水平。
[0003] 原发性肝癌主要包括肝细胞癌与肝内胆管细胞癌，肝内胆管细胞癌是原发性肝癌 的一种，其发病率占原发性肝癌的5~10%，尽管发病率低，但其发病率仍在不断增加。与 肝细胞癌相比，肝内胆管细胞癌发生的背景不同，恶性程度更高，早期诊断非常困难，发展 快，治疗效果差，预后差，特别是没有有效的药物治疗，5年生存率极低。
[0004] 有关肝癌的预防、诊断和治疗一直是医疗科学和技术领域内大家普遍关注的问题 和研究目标。目前肝癌治疗方法主要有外科关联的治疗有手术切除、肝脏移植，非外科治疗 方法有放射介入，超声介入、放疗以及药物治疗等。对肝癌病人的治疗方法主要根据每个病 人的具体情况，选择手术或非手术治疗，或多种方法联合治疗，如有的采用外科手术切除肿 瘤组织的方法加抗癌药物治疗，有的采用抗癌药物治疗的方法。
[0005] 然而，对于肝内胆管细胞癌，其治疗方法虽然基本上类似于肝细胞癌，但由于肝内 胆管细胞癌本身生物学行为，其治疗方法的选择与治疗效果与肝细胞癌有着很大的不同， 其治疗效果差，死亡率高，生存时间短。到目前为止，没有任何一个药物被批准用于肝内胆 管细胞癌的治疗。
[0006] 这是目前存在的主要问题，为什么存在这样的问题，重要原因之一就是对肝内胆 管细胞癌的生物学行为，特别是基因突变的特征没有搞清楚。可以预料，如果对于所有肝内 胆管细胞癌的病人都使用完全相同的治疗方案，如相同的药物，相同的剂量，以及完全相同 的治疗时间，其结果一定不完全相同。因此，最有效的方法是，首先搞清楚每一个肝内胆管 癌病人的基因突变情况，完全了解其个体化差异，然后根据这些具体基因突变，制定个性化 的治疗方案，选择针对每一个病人，某个突变基因靶点的合适药物的种类，剂量，时间等，只 有这样，才能获得最佳的治疗效果。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于寻找到肝内胆管细胞癌相关的基因突变靶点。
[0008] 本发明的另一目的在于提供这些基因突变靶点在诊断和/或治疗肝内胆管细胞 癌、评估肝内胆管细胞癌预后的试剂或试剂盒中的应用。
[0009] 本发明对102例肝内胆管细胞癌患者癌组织及其对照组织的全基因组外显子进 行测序，这是目前国内外对肝内胆管细胞癌最大样本的测序研究，测序数据高达200G，可见 根据本研究中发现的突变基因靶点制定肝内胆管细胞癌治疗方案，必将更加有针对性，更 加合理，可以获得有效的治疗效果。
[0010] 本发明拟提供一种完全根据肝内胆管细胞癌病人的基因测序结果而进行临床治 疗的方案和方法，即所谓的个性化治疗方案。
[0011] 本发明提供的个性化治疗方案，主要是根据两个方面的因素，一是每个病人的肝 内胆管细胞癌组织的全基因组外显子测序结果，二是每个病人的身体状况等，根据我们的 研究成果，对于每一个肝内胆管细胞癌的病人来说，其基因都存在变异。在所研究的102 例肝内胆管细胞癌患者中，发现有25个基因存在显著突变，其中8个基因，即TP53(p= 0? 0001)，KRAS(p= 0? 004)，IDH1(p= 0? 00019)，PTEN(p= 0? 0078)，ARIDlA(p= 0? 00449)， EPPKl(p= 0.00486)，ECE2(p= 0.0357)和FYN(p= 0.00258)可能为驱动基因；发现的 CTG>CAG和CAG>CTG突变目前仅见于肝内胆管细胞癌，且与肝内肝脏炎症、肝纤维化或肝 硬化具有很强的关联性；同时还发现P53基因突变主要发生于血清HBsAg阳性的肝内胆 管细胞癌（61. 54% )，KRAS基因突变基本唯一发生在血清HBsAg阴性的肝内胆管细胞癌 (29. 6 % )，此外，有三条信号转导通路（Ras/phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinasesignalling,p53/cellcyclesignalling和transforminggrowthfactor-b/Smadsignaling)极有可能与肝内胆管细胞癌发生、发展相关，约75%的病人存在p53/cell cyclesignaling和Ras/PI3Ksignaling信号通路上的变异。这些突变基因极有可能成为 未来肝内胆管细胞癌药物治疗的靶点。
[0012] 本发明的第一方面，提供了肝内胆管细胞癌相关的基因突变靶点，所述的基因突 变靶点是TP53(ID7157)、KRAS(ID3845)、IDH1(ID3417)、PTEN(ID5728)、ARID1A(ID 8289)、EPPK1(ID83481)、ECE2(ID9718)，或FYN(ID2534)。
[0013] 进一步地，本发明还提供了CTG>CAG和CAG>CTG突变目前仅见于肝内胆管细胞癌， 且与肝内肝脏炎症、肝纤维化或肝硬化具有很强的关联性；
[0014] 进一步地，本发明还提供了血清HBsAg阳性的肝内胆管细胞癌相关的基因突变靶 点是P53 ;血清HBsAg阴性的肝内胆管细胞癌相关的基因突变靶点是KRAS。
[0015] 本发明的第二方面，提供了上述的基因突变靶点TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN在制备诊断和/或治疗肝内胆管细胞癌的试剂或试剂盒中的应用。
[0016] 进一步地，P53在制备诊断和/或治疗血清HBsAg阳性的肝内胆管细胞癌的试剂 或试剂盒中的应用；KRAS在制备诊断和/或治疗血清HBsAg阴性的肝内胆管细胞癌的试剂 或试剂盒中的应用。
[0017] 本发明的第三方面，提供了上述的基因突变靶点TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN在制备肝内胆管细胞癌预后评估的试剂或试剂盒中的应用。
[0018] 进一步地，P53在制备血清HBsAg阳性的肝内胆管细胞癌预后评估的试剂或试剂 盒中的应用；KRAS在制备HBsAg阴性的肝内胆管细胞癌预后评估的试剂或试剂盒中的应 用。
[0019] 本发明的第四方面，还提供了一种检测试剂盒，其包含：（i)检测有效量的检测 TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子突变率的一种或多种试剂；（ii) 选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或 溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用 于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。
[0020] 本发明的检测试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂 盒进行检测，和如何利用检测结果对肝内胆管细胞癌发展进行判断、对治疗方案进行选择 和/或对预后进行评估。
[0021] 采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法（包括但不限于）检测TP53、 KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子：实时定量反转录PCR、生物芯片检测 法、DNA印迹法、或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要 对检测方式进行调整和改变。
[0022] 生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印迹法和原位杂交法可参考《分子印迹技术》刘 朝奇等主编，化学工业出版社出版。
[0023] 当然，所述试剂盒还包含临床上用于对象中肿瘤发展的判断、治疗方案的选择和 /或预后评估的其它试剂，以辅助或验证通过检测TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、 ECE2，或FYN分子所得到的结果。本领域普通技术人员可根据具体需要进行常规选择。
[0024] 通常，可利用本发明的检测试剂盒，采用如下方法进行肿瘤发展判断、抗肿瘤药物 制备和/或预后评估：(a)从对象获得待测样品；(b)使待测样品与本发明检测试剂盒中的 检测试剂接触；（c)检测该待测样品中TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2，SFYN 分子的水平，并将该水平与对照水平相比较；（d)根据检测结果进行肿瘤发展判断、抗肿瘤 药物制备和/或预后评估：如检测结果显示对象组织中的TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN分子的水平低于对照水平，则提示所述对象已患有肿瘤适于采用提高 TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2，或FYN分子的量的治疗方法来治疗肿瘤、或肿 瘤预后不良。
[0025] 如本文所用，术语"对照水平"是指用作参照的TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN分子的水平，其包括但不限于：由同一对象的非肿瘤正常生物样品 (例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品）中测得的TP53、KRAS、IDH1、PTEN、 ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水 平。
[0026] 可用于提示所述对象已患有肿瘤适于采用提高TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN分子的治疗方法来治疗肿瘤、或肿瘤预后不良的水平差异可为：待测 样品中的TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子水平比对照水平低 10-50 %，优选 20-40 %，更优选 30-35 %。
[0027] 如本文所用，术语"预后"是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特 定后果（如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡）。本发明中 所述的预后不良包括但不限于：生存期缩短、易发肝硬化、肿瘤数量增加快、肿瘤变大加快、 门静脉癌栓出现比例增加、?M分级上升等。在预测了患者预后情况后，可结合提高TP53、 KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子的量的治疗方法改善患者的预后。
[0028] 本发明的有益效果在于：
[0029] 本发明基于肝内胆管细胞癌病人的全基因组外显子测序结果，即根据此类病人的 外显子突变情况所采取的对应临床治疗方案，有助于评估病情，更有助于治疗方法的选择 与评估。正是由于本发明给出的临床医疗方案和方法是基于病人的全基因组外显子检测大 数据分析结果所制定的，其所采用的临床治疗方案更加个体化，它比其它方法更加具有针 对性与靶向性，也将会有更好的治疗效果。本发明发现了与肝内胆管细胞癌相关的基因突 变靶点TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2，或FYN，这些基因突变靶点可有效用于 肝内胆管细胞癌发展判断、治疗方案选择和/或预后评估，从而为本领域提供了一种新颖 的肝内胆管细胞癌诊断剂和/或治疗剂，具有一定的临床应用前景。
【附图说明】
[0030] 图1中A:P53突变氨基酸位点改变；B:肝内胆管细胞癌P53突变及其与患者生存 关系：有P53基因突变肝内胆管细胞癌患者预后明显低于没有P53基因突变患者；图中英 文注释相对应的中文译文：P53转录激活区（p53_TAD) ;P53DNA结合区（p53DNA-binding domain) ;P53四聚体（p53_tetramer);框架插入与缺失（InframeInDel);移码插入与缺失 (FrameshiftInDel);错义突变（Missense);无义突变（Nonsense);剪接位点（Splicing sites);生存率（Percentsurvival);生存时间（月）（surviv