不含有信号肽的在马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株中进行外源基因表达的重组载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种在营养缺陷型菌株中使用的重组表达载体，尤其涉及一种不含有 信号肽的重组表达载体。
【背景技术】
[0002] 酵母是单细胞的真核生物，它兼具微生物的特性和真核生物的蛋白合成加工系 统。因此，它被广泛的用于表达多种外源真核蛋白。目前主流的酵母表达系统包括毕赤酵 母和酿酒酵母表达系统。但是，毕赤酵母的蛋白表达需要用甲醇诱导，不适合用于食用蛋白 的生产。酿酒酵母易产乙醇，生长密度低，表达水平偏低。针对这一系列问题，发展新型的 安全性高和产量高的酵母表达系统具有很高的工业价值。
[0003] 马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)已经通过了美国和欧洲的GRAS 和QPS安全认证，其自身不仅被认为是安全的微生物菌株，同时也被认为是可用于制备食 品级重组蛋白（酶）的安全微生物菌株，是一种被欧盟认可的食品级的酵母。它具有营养 要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广等特点。同时，它还具有高效分泌 蛋白的特点。因此，马克思克鲁维酵母具有高效表达食用和饲用蛋白的巨大潜力。
[0004] 表达系统由宿主菌和表达载体构成。对于食品安全级别的酵母表达系统，宿主菌 通常选用营养缺陷型标记。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种在营养缺陷型菌株中进行外源基因表达的重组载体。
[0006] 本发明第一个方面是提供一种不含有信号肽的在马克斯克鲁维酵母营养缺陷型 菌株中进行外源基因表达的重组载体，按照顺序包括氨苄抗性基因、PKD1载体、菊粉酶启动 子、多克隆位点、菊粉酶终止子、营养基因启动子、营养基因开放阅读框（0RF)。
[0007] 其中，所述营养基因优选为马克斯克鲁维菌株的营养基因，如URA3基因、HIS3基 因、ADE2基因中的任意一种或几种，更优选为URA3基因。
[0008] 其中，所述多克隆位点可以是包括一个或多个位点限制性酶切位点的序列，所述 限制性酶切位点如SmaI、XmaI、SpeI、NotI中的任意一种或几种，更优选为SpeI、NotI、以及 Smal和/或Xmal中的任意一种或几种，如Smal/Xmal、Spel、Notl。
[0009] 其中，所述多克隆位点长度优选为15_25bp，更优选为18_23bp，更优选为 19-21bp〇
[0010] 在本发明的一种优选实施例中，所述重组载体的DNA序列如SEQIDNo. 1所示。
[0011] 本发明第二个方面是提供一种构建上述重组载体的方法包括：
[0012] 扩增pUC19质粒、PKD1载体，获得pUC19与PKD1连接的片段I ;
[0013] 扩增马克思克鲁维酵母基因组，获得包含营养基因启动子或0RF的片段II;
[0014] 扩增马克思克鲁维酵母基因组，获得包含菊粉酶基因启动子、菊粉酶信号肽、和部 分多克隆位点的片段III;
[0015] 扩增马克思克鲁维酵母基因组，获得包含菊粉酶终止子和部分多克隆位点的片段 IV，
[0016] 将片段I、II、III、IV进行连接，获得第一重组载体。
[0017] 使用定点突变试剂盒，对所述第一重组载体进行突变，获得所述不含信号肽的重 组载体。
[0018] 其中，所述定点突变试剂盒优选为QuikChangeII试剂盒。
[0019] 其中，所述突变所用引物优选为：
[0020] 5 '-ATAAGTGACACATTTAATTTTTTTTTTGTTAGATACTAGTCCCGGGGCGGCCGCTTAAGGCCGCAA GCTT-3' ；
[0021] 5 ?-AAGCTTGCGGCCTTAAGCGGCCGCCCCGGGACTAGTATCTAACAAAAAAA AAATTAAATGTGTCACTTAT-3'。
[0022] 其中，扩增pUC19质粒的引物优选为：
[0023] 正向引物：
[0024]5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'；
[0025] 反向引物：
[0026] 5'-TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3' 。
[0027] 其中，扩增PKD1质粒的引物优选为：
[0028] 正向引物：
[0029] 5'-CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3' ；
[0030] 反向引物：
[0031] 5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3' 。
[0032] 其中，在一种优选实施例中，获得pUC19与PKD1连接的片段I方法如下：扩增 PUC19质粒得到A片段，扩增Gateway系统载体的pcYGW获得B片段，扩增PKD1载体获得 C片段，将A、B和C片段连接，将连接得到的质粒进行扩增，得到包括pUC19与PKD1的片段 1〇
[0033] 其中，扩增pcYGW所用引物优选为：
[0034] 正向引物：5'-GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3' ；
[0035] 反向引物：5' -GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'。
[0036] 其中，扩增质粒的引物优选为：
[0037] 正向引物：5'-GATCCGCTTAAGAGGGGTACCGAGCTCGAATT-3' ；
[0038] 反向引物：
[0039] 5'-ACCTTTTCGGATCGGCATGCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3' 。
[0040] 其中，扩增获得片段II的引物优选为：
[0041] 正向引物：5'-CTAGGATCGGTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATT-3' ；
[0042] 反向引物：5' -GTACCCCTCTTAAGCGGATCTGCCTACTCTCTTCA-3'。
[0043] 其中，扩增获得片段III的引物优选为：
[0044] 正向引物：5'-GCATGCCGATCCGAAAAGGTAAACAGACACAAAAAC-3' ；
[0045] 反向引物：
[0046] 5'-GTCCCGGGGTCACCGTCTCTCTTGTAATTGATCACTGAAG-3' 。
[0047] 其中，扩增获得片段IV的引物优选为：
[0048] 正向引物：
[0049] 5'-ACGGTGACCCCGGGACTAGTGCGGCCGCTTAAGGCCGCAAGCTTTGATCTG-3' ；
[0050] 反向引物：5' -CAGAATTCGACCGATCCTAGAATGTTGGTCAGATGTG-3'。
[0051] 本发明第三个方面是提供一种转化子，将外源基因插入到所述重组载体的多克隆 位点中，获得含有外源基因的质粒，将所述质粒转入营养基因缺陷型菌株中，获得所述转化 子。
[0052] 其中，所述营养基因缺陷型菌株优选为营养基因缺陷型马克斯克鲁维菌株。
[0053] 所述营养基因缺陷优选为包括URA3基因、HIS3基因、ADE2基因缺陷中的任意一种 或几种，更优选为URA3基因缺陷。
[0054] 本发明构建的不含有信号肽的重组载体，可用于构建转化子，来实现外源基因的 表达。
【附图说明】
[0055] 图1为本发明实施例中所构建重组载体原理图；
【具体实施方式】
[0056] 步骤1，扩增pUC19质粒
[0057] 正向引物：
[0058] 5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'
[0059] 反向引物：5' -TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3'
[0060] 利用所述引物扩增pUC19质粒。PCR扩增反应按照Vazyme公司的PhantaSuper FidelityDNAPolymerase的使用说明书进行，退火温度为58°C，延伸时间为3分钟，30个 循环。PCR产物命名为A片段。
[0061] 步骤2,扩增Gateway系统载体的pcYGW
[0062] 正向引物：5, -GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3，
[0063] 反向引物：5, -GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'
[0064] 利用所述引物扩增Gateway系统载体的pcYGW。PCR扩增条件同步骤1，除了延伸 时间为1分钟。PCR产物命名为B片段。
[0065] 步骤3，扩增PKD1载体
[0066] 正向引物：5' -CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3' 反向引物：