甘蓝型油菜基因BnMPK3及其抗油菜菌核病的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因及其或其功能类似物调控植物抗菌核病在农业生产中的应用，属于植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]油菜作为一种重要的油料作物，在中国的油料生产中占有重要的地位。我国油菜年种植面积700万公顷(I亿亩)，占全世界的1/3，居世界首位，其所产菜籽油占我国整个食用植物油供应的40% (沈金雄等，中国油菜生产及遗传改良潜力与油菜生物柴油发展前景[J]，华中农业大学学报，2007年，26卷6期894-899页)。此外，菜籽油也是适宜于生产的生物柴油，油菜已被欧美各国作为解决全球能源短缺的重要原料作物。因此油菜不仅是食用油的主要来源，也是解决全球能源短缺的重要原料作物，具有十分重要的战略地位。
[0003]然而，我国的菜籽生产量目前仅能满足国内2/3的消费需求，大量依赖进口。我国2005年进口植物油600多万吨，是世界上最大的油料进口国，随着人口数量的增长和人民生活水平的提高，按目前的生产规模，缺口将会变得更大(王汉中，中国油料产业发展的现状、问题与对策[J]，中国油料作物学报，2005年，27卷4期100-105页)。在当前和今后相当长的时间内，我国都将面临食用油和化石能源短缺的严峻局面。
[0004]油菜菌核病(scIerot1rum (Lib.) de Bary)是限制我国油菜生产的主要因子之一。在长江中下游及东南沿海油菜主产区，油菜菌核病的发生率很高，产量损失高达50%以上；全国发生面积在7000万亩以上，产量损失高达30%，严重时达到50-80%。目前油菜菌核病的防治方法主要是化学防治技术和抗病品种的选育，但化学防治存在防效不高、病原难以根除、花期喷药困难以及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种因难以找到有效的抗性材料以及速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。由此，对抗菌核病油菜品种进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，是提高菜籽单位面积产量的重要策略。
[0005]基因工程方法是按预先设计好的目标和计划，通过遗传操作，在分子水平上改良品种的技术。中国农业科学院作物科学研究所发现了一个植物抗病基因为基因a或基因b，将基因a或基因b修饰后对植物的抗性有显著提高(申请号:201110048518.9，2011)。而像油菜菌核病这类在寄主植物种内难于找到抗原的病害，基因工程方法提供了一种解决问题的途径。
[0006]促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activitedprotein kinases，MAPKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞中对各种生长因子进行应答，迅速在其丝氨酸、苏氨酸残基部位磷酸化而被激活。它广泛存在于各种真核生物中，与一些其他的信号分子组成MAPK级联途径(MAPK cascades)，该途径与激素反应、细胞分化和发育过程密切相关。山东农业大学研究发现，棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因河以使棉花叶片面积增大，果荚数和结实率提高，从而提高棉花产量(郭兴启等，2010 ;申请号:201010590833)。在植物中，MAPK除了与许多生命活动有关外，在应对冷、热、氧化、紫外线、干旱、病原体侵害等多种非生物和生物胁迫方面起着重要作用。有学者发现，水稻的与水稻抗低温有关(Huang Fu et al.Express1n of Oryzasa tiva MAP kinase gene is developmentalIyregulated and stress-responsive [J].Phys1l Plant，2012 年，114 期，572-580 页)。华中农业大学发现，枳促分裂原活化蛋白激酶基因可以提高转基因烟草植株抗旱能力，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供了新的基因资源(刘继红等，2010 ;申请号:201010596044)。促分裂原活化蛋白激酶基因MPK3是MAPK家族的重要一员，Mao等的研究表明，在拟南芥中通过激活促进植物植保素的合成，从而起到抗拟南芥灰霉病的作用(Mao et al.Phosphorylat1n of a WRKY transcript1n factor by twopathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin b1synthesis in Arabidopsis[J].Plant Cell, 2011年，23期，1639 - 1653页)。目前已证明基因如有抗油菜菌核病的作用(Wang Zheng et al.0verexpress1n of BnWRKY33 in Oilseed RapeEnhances Resistance to Sclerotinia sclerot1rum.Molecular Plant Pathology[J].Molecular Plant Pathology, 2014年)。因此我们推测，&堪因也具有提高甘蓝型油菜对菌核病抗性的功能，在加拿大油菜中，已有研究者克隆出汾?#/?堪因，(Liang et al.1dentificat1n and analysis of MKK and MPK gene families in canola (BrassicanapusL.).BMC Genomics，2013年)，但目前对于抗菌核病这一方面的研究还未见有文献及专利的报道。研究发现，菌核病对油菜胁迫处理之后，汾?#/??的表达显著提高，进而，甘蓝型油菜转基因过表达植株显著增强菌核病抗性，这一结果在增强油菜菌核病抗性和提高菜籽油产量上具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，根据一种来源于油菜的控制作物菌核病的基因，其命名为汾?#/??其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示堪因编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0008]本发明提供带有堪因的重组载体1300-35S-MPK3-N0S。
[0009]所述重组载体1300-35S-MPK3-N0S的具体制备方法为:在载体pCAMBIA1300 (购于北京鼎国昌盛生物公司)的上游EcoRI/Kpnl酶切位点处加入CaMV 35S强启动子，其下游BamHI/Hindlll酶切位点处加上CaMV Nos终止子，将其改造成载体pCAMBIA1300-35S_Nos ；而重组载体1300-35S-MPK3-N0S是以
BnMPK3-\-Y (5， -GGTACCTCTTCTCATTTCAGTCCCTCA-3’ )，
BnMPK3~l~R (5， -GGATCCGGATATTTAGCCATTCATTCG-3’ )
为引物从甘蓝型油菜中双9号的cDNA中扩增出目的基因BnMPK3 (该对引物是以NCBI上公布的拟南芥(Gene ID: 823706)的编码序列设计的)，进而按照gateway试剂盒(Gateway? LR Clonase ? II Enzyme Mix，Invitrogen Corporat1n)操作，将目的基因克隆到 pCAMBIA1300-35S-Nos 的酶切位点 KpnI/BamHI 上，得到 1300-35S-MPK3-N0S。
[0010]本发明进一步提供所述&7#/兄堪因在提高油菜对菌核病的抗性中的应用，本发明通过过量表达该基因来达到提高甘蓝型油菜对死体营养型病菌菌核病的抗性。
[0011]实现本发明的技术如下:
创建甘蓝型油菜CDNA文库，以
BnMPK3-l-Y 汔，-GGTACCTCTTCTCATTTCAGTCCCTCA-3’)， BnMPK3-l-卿-GGATCCGGATATTTAGCCATTCATTCG-3?)为引物，从甘蓝型油菜中双 9 号的cDNA文库中PCR扩增出甘蓝型油菜BnMP_ cDNA序列，进行测序，发现这个cDNA序列全长为1299bp，在GenBank数据库对其Blast核苷酸比对，发现这个cDNA序列与拟南芥、烟草等的转录因子MPK3在核苷酸水平上有很高的同源性。
[0012]为了探测MPK3对菌核病侵染的反应，用核盘菌(从甘蓝型油菜中双9号品种分离，购于中国农科院植物油料所)接种油菜叶片，分别在接种0、12、24、36、48 h时采样然后提取叶片总RNA，然后使用实时荧光定量P CR检测BnMPK:m表达量；用携带有1300-35S-MPK3-N0S载体的农杆菌GV3101 (购于上海迈其生物科技有限公司)以浸花法转化甘蓝型油菜，采用PCR技术鉴定出转基因株系，通过实时荧光定量PCR技术鉴定出表达水平显著高于非转基因株系的过表达转基因株系。菌核病抗病评价实验表明，与非转基因株系相比，汾?#/??过表达转基因株系显著提高菌核病抗性。
[0013]这些结果表明堪因在增强油菜菌核病抗性上具有重要的应用前景。
[0014]本发明的优点:
1.本发明中所采用的从油菜CDNA文库来克隆基因，可靠性高、速度快、效率高。
[0015]2.本发明中所采用的农杆菌介导的体外浸蘸渗透法转化油菜，速度快、成本低、操作简单。
[0016]3.本发明中克隆得到的如斯尤堪因，为其它作物抗病育种提供了新的基因源；为研究怎样提高其它作物的菌核病抗性具有指导借鉴作用。
[0017]4.本发明构建的1300-35S-MPK3-N0S载体转化油菜后获得的MPK3过量表达株系，从如#/尤?的功能获得方面进行研究，为#/??的抗病功能研究提供了原材料，具有重要意义。
[0018]5.本发明通过对7???过量表达株系在抗菌核病方面的一系列研究，充分证明了#/?堪因在植物抗菌核病方面有积极作用