一种基于ercc8基因检测胃癌易感性的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医疗研究领域，涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，具体涉及 一种基于ERCC8基因检测胃癌易感性的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 胃癌的发生与多种因素有关，其中饮食习惯，生活环境以及幽门螺杆菌的感染等 均是导致胃癌发生的高危因素。遗传因素也是一项重要的方面。基因的多态性是导致疾病 发生遗传以及疾病发生遗传易感性的重要方面。其中以单核苷酸多态性最为常见。
[0003] 单核苷酸多态性由于是人类基因组中最为常见的多态形式，因此其可以作为人类 疾病的一种特有基因。某一个或者几个的单核苷酸多态性可以代表某个单体区域的单核苷 酸多态性称之为标签单核苷酸多态性。
[0004] DNA修复基因的主要作用是为了保持基因组中DNA的完整性以及其相关的稳定 性。当DNA出现损伤时DNA可以有自身的修复能力。但不同个体其DNA修复能够存在有一 定的差异。目前有研究表明，DNA修复基因的序列会影响DNA的修复能力。
[0005] ERCC8是转录偶联修复的核心基因，其主要是参与DNA修复过程中的转录偶联修 复，并且修复氧化损伤以及与多种的重要蛋白质有着相对交互作用。ERCC8基因启动子区、 编码区、内含子区均存在多个SNPs，这些SNPs可能影响到基因转录水平、剪接方式、翻译效 率和蛋白质的功能等，从而影响不同个体的DNA修复的能力。因此研究ERCC8基因是有重 要意义。
[0006] DNA修复基因ERCC8Tag SNPs与胃癌及其癌前疾病发病风险研究（景晶晶，中国 医科大，2012)中对辽宁庄河胃癌高发区进行研究发现，携带ERCC8_rsl58572位点GG/AG基 因型者罹患胃癌的风险增高，尤其是50岁以上男性具有更高的胃癌发病风险。
[0007] 本发明通过对胃癌患者进行ERCC8基因SNPs的检测，发现了与上文报道不一致的 结论。
【发明内容】
[0008] 为解决上述问题，本发明提供了一种基于ERCC8基因检测胃癌易感性的试剂盒及 其用途。
[0009] 第一方面，本发明提供了一种基于ERCC8基因检测胃癌易感性的试剂盒，包括：检 测ERCC8基因上rsl58572号SNP位点的特异性引物和/或检测ERCC8基因上rsl58916号 SNP位点的特异性引物。
[0010] 优选地，所述检测ERCC8基因上rsl58572号SNP位点的特异性引物为：
[0011] 3￡〇10勵:5及5￡〇10勵:6组成的引物对；或5￡〇10勵:7及5￡〇10勵:8组 成的引物对。
[0012] 优选地，检测ERCC8基因上rsl58916号SNP位点的特异性引物为：
[0013] SEQ ID N0:11 及 SEQ ID N0:12 组成的引物对。
[0014] 优选地，所述检测ERCC8基因上rsl58572号SNP位点的特异性引物和检测ERCC8 基因上rsl58916号SNP位点的特异性引物为用于多重PCR反应的多重PCR引物组，所述的 多重？〇?引物组为5￡0 10勵:5、5￡0 10勵:6、5￡0 10勵：11及5￡0 10勵：12组成的多重 PCR引物组。
[0015] 优选地，所述胃癌易感性的检测为针对云南省（优选为文山州）地区人群进行的 胃癌易感性检测。
[0016] 第二方面，本发明提供了一种评估人群胃癌易感性的方法，包括如下步骤：
[0017] 1)采用如第一方面所述的试剂盒对待测人群的ERCC8基因rsl58572号和/或 rsl58916号SNP位点的基因型进行检测；
[0018] 2)检测待测人群是否感染幽门螺杆菌；
[0019] 3)对步骤1)和2)的检测结果进行统计，并对ERCC8基因rsl58572号和/或 rsl58916号SNP位点与幽门螺杆菌感染交互作用进行分析，获得人群胃癌易感性的评估结 果。
[0020] 优选地，所述步骤1)中，采用如第一方面所述的试剂盒中的多重PCR引物组进行 多重PCR反应检测待测人群的ERCC8基因rsl58572号和rsl58916号SNP位点的基因型。
[0021] 进一步优选地，每个多重PCR反应体系中采用的多重PCR引物组总浓度为12uM。
[0022] 进一步优选地，所述多重PCR反应程序为：
[0023]
[0024] 优选地，所述的待测人群为云南省（优选为文山州）地区人群。
[0025] 第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的基于ERCC8基因检测胃癌易感性 的试剂盒在检测ERCC8基因上的rsl58572号和/或rsl58916号SNP位点中的应用。
[0026] 本发明提供的基于ERCC8基因检测胃癌易感性的试剂盒可用于准确ERCC8基因的 rsl58572和rsl58572号SNP位点的基因型的检测。
[0027] 本发明发现：对比观察组和对照组两组受试者rsl58572关于AA，GA和GG的基因； 以及和rsl58916关于TT，CT和CC的基因。观察组和对照组两组受试者在rsl58572的基 因位点没有统计学差异（P > 〇. 05)，同时rsl58916两组的基因位点也没有统计学差异（P > 0. 05)；
[0028] 本发明还发现：幽门螺杆菌感染发病与两个tag SNPs有一定的相关性。携带 ERCC8基因的rsl58572和rsl58572同时感染幽门螺杆菌，导致胃癌的风险会大大增加。
【附图说明】 图 1 是本发明实施例提供的SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12 的多重？〇?结果以及5￡0 10勵：7、5￡0 10勵:8和5￡0 10勵：11、5￡0 10勵：12的多重 PCR结果； 图 2是本发明实施例提供的SEQIDN0:5、SEQIDN0:6和SEQIDN0:11、SEQIDN0:12 的多重PCR结果。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 仪器与试剂。所有的DNA引物均哟上海的英骏生物公司提供，采用酚氯仿法抽提 基因组。DNA Marker:东胜生物，Low ladder/marker，M1031。具体步骤如下：
[0032] 实施例1 SNP筛选
[0033] 采用Haploview的软件进行ERCC8基因的tagSNP筛选。然后再采用FastSNP对 候选的tagSNPs进行功能和风险预测，从而能够挑选一种具有潜在功能效应的SNPs。其中 对tagSNPs的风险评估依据主要是采用遗传风险评估方案进行评分。通过筛选，本文捕获 两个潜在的tagSNPs(rsl58572以及rsl58916)。同时需要进行基因型检测。
[0034] 实施例2DNA样品提取
[0035] 将采集的凝血块500 y 1大小并且将其置于离心管中，加入800 y 1的TE，混匀后进 行DNA的提取。混匀后进行离心操作，10000rpm/min，离心5分钟。然后依次加入400 y 1 的LTE，25 y 1的10%的SDS和5 y 1浓度为20mg/ml的PK液，过夜消化。消化结束后将其 上清液吸取并且同时加入等体积的酚，涡旋15分钟后再次离心。吸取上清液后加入1 :1的 氯仿和酚，再次涡旋离心。再吸取上清液，加入2倍的无水乙醇和3M的乙酸钠，在-20°C的 条件下进行沉淀反应。沉淀接受后弃去上清液，然后加入75%的乙醇再次离心。取出上清 液后将离心后的沉淀物质干燥，待用。
[0036] 实施例3引物设计
[0037] 采用MassAssayDesign3. 1 (美国sequenom公司）进行引物设计，设计PCR扩 增引物及延伸引物。
[0038] PCR扩增引物：
[0039] 针对rsl58572号SNP位点的特异性引物设计4对：
[0040] 第 1 对：
[0041] (SEQID N0:1)
[0042] 正义引物：5 ' -GGATCAITTGAGCCTGGAAA-3 '（Tm 值为 60 °C )，
[0043] (SEQIDNO:2)
[0044] 反义引物：5' -TGCCACTGTCACTTCCTCTG-3'（Tm 值为 60°C );
[0045] 第 2 对：
[0046] (SEQID NO:3)
[0047] 正义引物：5 ' -GCCCTTGAGATAAACCCACA-3 '（Tm 值为 59 °C )，
[0048] (SEQIDNO:4)
[0049] 反义引物：5' -CGGGAGAGAGITGTTGGAAG-3'（Tm 值为 59°C );
[0050] 第 3 对：
[0051] (SEQIDNO:5)
[0052] 正义引物：5'-AAGGCAGGAGGATCACTTCA-3'（Tm值为 59°C)，
[0053] (SEQIDNO:6)
[0054] 反义引物：5' -ACAATCAGCATGITCCCACA-3'（Tm值为 59°C);
[0055] 第 4 对：
[0056] (SEQIDNO:7)
[0057] 正义引物：5' -GGTGAITGGTCACTGTGCAT-3'（Tm值为 59. 5°C)，
[0058] (SEQIDNO:8)
[0059] 反义引物：5' -TGCCACTGTCACTTCCTCTG-3'（Tm值为 60°C);
[0060] 针对rsl58916号SNP位点的特异性引物设计3对：
[0061] 第 1对：
[0062] (SEQIDNO:9)
[0063] 正义引物：5' -CTATGGCCAAGCACTCACAC-3'（Tm值为 59. 5°C)，
[0064] (SEQIDNO: 10)
[0065] 反义引物：5' -TTACCTTCCCACCAGGAGTG-3'（Tm值为 60°C);
[0066] 第 2 对：
[0067] (SEQIDNO: 11)
[0068] 正义引物：5' -TGTGGGACAGTCTCAAATGG-3'（Tm值为 59. 5°C)，
[0069] (SEQIDNO: 12)
[0070] 反义引物：5' -TCCCACCAGG