一套用于金黄色葡萄球菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于金黄色葡萄球 菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡 萄球菌属（Staphylococcus)，有"嗜肉菌〃的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严 重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公布 食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金葡菌限量存在。
[0003] 目前金黄色葡萄球菌的检测方法分为两类，一类是传统的培养及其改进方法，依 赖于生化与形态学特点，检测周期较长，可操作性差；一类是聚合酶链式反应（polymerase chain reaCti〇n，PCR)相关方法，包括普通PCR方法以及实时荧光PCR方法，主要是针对金 黄色葡萄球菌区别于葡萄球菌属其它细菌的多个靶基因，选择特异序列，建立PCR以及实 时荧光PCR方法。金黄色葡萄球菌PCR相关检测方法近年来发展迅速，由于其快速、灵敏、 特异的特性，已经成为食源性病原微生物的可靠检测方法。
[0004] 质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在 PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定 量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研 究和应用，但是针对金黄色葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物质还是空白。 在实际金黄色葡萄球菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子 作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分 子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一套适用于金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测的质 粒标准分子及其应用。
[0006] 本发明的另一目的是提供一套适用于金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测的 质粒标准分子及其应用。
[0007] 本发明的第一方面，提供了一套分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含金黄色葡萄 球菌的耐热核酸酶基因nuc基因序列。
[0008] 在另一优选例中，所述金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc的基因序列选自下 组：
[0009] (a)序列如SEQ ID N0. : 1所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)核苷酸序列与SEQ ID N0. : 1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0011] (C)序列与SEQ ID N0. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQ ID NO. :1所示序列长度的20% -100% (较佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0012] (d)与（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0013] 在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQIDN0. : 1所示。
[0014] 本发明的第二方面，提供了一套分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明 第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。
[0015] 在另一优选例中，所述DNA构建物中包含金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc 序列。
[0016] 在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
[0017] 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。
[0018] 在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为金黄色葡萄球菌检测的标准分子 (质粒标准分子）。
[0019] 在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19, pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScript II SK 和 pGEM。
[0020] 本发明的第三方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述 的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0021] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增金黄色葡 萄球菌耐热核酸酶基因nuc的基因序列。
[0022] 在另一优选例中，特异性扩增金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc的基因序列的 所述的引物对选自下组：
[0023] SEQ ID N0. :3 和 SEQ ID N0. :4 所示的引物对；
[0024] SEQ ID N0. :5 和 SEQ ID N0. :6 所示的引物对；
[0025] SEQ ID N0. :7 和 SEQ ID N0. :8 所示的引物对；
[0026] SEQ ID N0. :9 和 SEQ ID N0. : 10 所示的引物对；
[0027] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述所述引物对特异性扩增金黄 色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc序列。
[0028] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQ IDN0. : 11 所示。
[0029] 本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第二方面 所述的DNA构建物、或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于金黄色葡萄 球菌的检测。
[0030] 在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。
[0031] 在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
[0032] 本发明的第五方面，提供了一套金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法，所 采用的标准物质是如本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的DNA构建 物。
[0033] 本发明的第六方面，提供了一套多核苷酸产品，所述产品包括：
[0034] (i)金黄色葡萄球菌标准品，所述的标准品选自：本发明第一方面所述的多核苷 酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物；
[0035] (ii)特异性扩增金黄色葡萄球菌序列的引物对，所述引物对为：
[0036] SEQ ID N0. :3和SEQ ID N0. :4所示的序列构成的引物对。
[0037] 在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合（combination)，较佳地所述组分 ⑴和（ii)是各自独立的。
[0038] 在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。
[0039] 本发明的第七方面，提供了一套金黄色葡萄球菌的质粒标准分子的制备方法，包 括以下步骤：
[0040] ①人工合成金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc序列，所述金黄色葡萄球菌的 耐热核酸酶基因nuc序列如SEQ ID N0. : 1所示；
[0041] ②将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到金黄色葡萄球菌的质粒标准分 子。
[0042] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19, pUC18, pUC118, pUC119， pBlueScript II SK 或 pGEM。
[0043] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19。
[0044] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0045] 图1是本发明质粒标准分子LY03的图谱。
[0046] 图2是本发明所得质粒标准分子LY03稳定性检测结果图。
[0047] 图3是利用本发明质粒标准分子LY03建立的实时荧光PCR标准曲线。
【具体实施方式】
[0048] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于金黄色葡萄球菌PCR检测的 多核苷酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒将所述多核 苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳 的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。
[0049] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的金黄色葡萄球菌实时荧光PCR检 测方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一套适用于金黄色葡萄球菌实 时荧光PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法和应用。
[0050] 检测菌株
[0051] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡 萄球菌属（Staphylococcus)，有"嗜肉菌〃的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严 重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公 布食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金葡菌限量存在。
[0052] 本发明人发现，金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc(对应检测质粒标准物质 LY03)适宜作为检测基因。耐热核酸酶基因nuc位点在金黄色葡萄球菌的染色体内，保证金 黄色葡萄球菌具有耐热性，因此，它们可以作为金黄色葡萄球菌菌种检测的关键基因。
[0053] 实时荧光PCR检测金黄色葡萄球菌的原理
[0054] 采用实时荧光PCR技术可特异性扩增金黄色葡萄球菌基因组DNA中耐热核酸酶 nuc基因序列，设计针对以上靶基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实 时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、 探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子）。PCR方法中，阳性标准物质 (或阳性标准分子）可以作为阳性对照；实时荧光PCR中，阳性标准物质（或阳性标准分子） 可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应基因