含有适合用于缺血性疾病治疗的细胞的细胞群体的体外增殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及增殖和/或修饰含有来自无血清培养下的单核细胞级分的血管内皮 祖细胞（vascular endothelial progenitor cell)的细胞群体的方法(所述细胞适合用于 缺血性疾病的治疗)，通过所述方法获得的细胞群体，用于缺血性疾病的含有所述细胞群体 的治疗剂的生产方法，等。
[0002] 背景领域 针对缺血性心脏病，在近年已经应用了骨髓单核细胞移植治疗和通过收集外周血干细 胞使用内皮祖细胞（EPC)的细胞移植治疗。因此，已经特别地期望用于培养大量EPC的技术 的出现。通过本发明人开发的来自CD34和/或CD133阳性细胞的血管内皮祖细胞的体外 增殖方法已经使得提供EPC的有效培养技术成为可能(专利文件1)。由本发明人发明的分 析血管内皮细胞的分化中的动力学的方法已经阐明了内皮细胞样大型集落(分化的EPC集 落）形成细胞和内皮细胞样小型集落(未分化的EPC集落）形成细胞的存在，其已经使得能 够预测和理解细胞移植的治疗效果(专利文件2)。此外，本发明人已经展示了从骨髓单核细 胞有效增殖⑶34和/或⑶133阳性细胞的方法(专利文件3)。
[0003] 在另一个方面，已经报道了 EPC的血管再生能力通过EPC和称为血管生成T细胞 并存在于CD34阴性细胞群体中的CD3阳性-CD31阳性细胞的共培养而提高，并且暗示了所 述CD34阴性细胞群体含有提高EPC能力的细胞(非专利文件1)。
[0004][文件列表]
[专利文件] 专利文件 1: W0 2006/090882 专利文件 2: W0 2006/090886 专利文件 3: W0 2006/093172 [非专利文件] 非专利文件 1: Circulation 2007，116: 1671-1682。
[0005] 发明概述 通过本发明解决的问题 如上文提及的文件中显示的，本发明人发展了新的EPC培养技术，但是其中的EPC制 备步骤仍需要时间和成本因为CD34和/或CD133阳性细胞需要从外周血等分选。此外，如 在上文提及的非专利文件1中，能够提高EPC的能力的细胞可以存在于CD34阴性细胞群体 中。因此，如在上文提及的专利文件3中，研究了在没有分选CD34和/或CD133阳性细胞 以获得EPC级分的情况下，或通过在给定比例混合CD34阳性细胞和CD34阴性细胞的情况 下用于培养单核细胞的条件。结果，其证实了，认为具有分化至血管内皮细胞的高潜力的分 化的(大类型)EPC集落形成细胞通过本发明的方法有效增殖，并且令人惊讶地，在血管发生 作用以及组织可修复性中，通过所述方法获得的培养或细胞群体优于通过培养CD34和/或 CD133阳性细胞获得的培养或细胞群体，因为它们具有炎症抑制作用连同优异的血管内皮 形成性，并且对缺血性疾病的治疗有效。
[0006] 因此，本发明的问题是简化用于缺血性疾病治疗的细胞群体的制备步骤，和提供 显示更多治疗效果的细胞群体。更具体地，所述问题是通过在骨髓、脐带血和外周血的收集 后的细胞分选的简化，提供用于细胞群体增殖的方法，所述细胞群体不但包括血管再形成 细胞：特别地，具有高血管生成能力的分化的EPC集落形成细胞，还包括抗炎性/免疫耐受 诱导细胞：特别地，转化为抗炎性的M2巨噬细胞、T淋巴细胞亚群体、调节T细胞。
[0007] 解决问题的方法 鉴于上文提及的问题，本发明人研究了能够实现在不进行体外单核细胞分选的情况 下，或通过混合CD34-分选的、未分选的细胞的，使这些细胞分化/增殖成有利于血管生成 的细胞群体的培养条件。结果，他们通过在含有选自（1)干细胞因子（SCF)、（2)白介素-6 (IL-6)、（3) FMS-样酪氨酸激酶3配体（FL)和（4)血小板生成素和（5)血管内皮生长因子 (VEGF)的因子的无血清培养基中培养单核细胞，已经成功地在体外进行了含有EPC的细胞 群体的有效的增殖。含有EPC的细胞群体的特征在于其特别地含有EPC和抗炎性M2巨噬 细胞，并且还含有抗炎性T淋巴细胞亚群体和调节T细胞。因此，已经阐明该细胞群体不但 显示血管发生，还具有抗炎作用。此外，本发明人已经阐明具有相似功能的细胞群体还可以 在从不但是健康的个体还可以是糖尿病患者收集的细胞群体中获得。
[0008] 特别地在用于培养的单核细胞中，其已经阐明当⑶34阳性细胞和阴性细胞在给 定的比例培养时，可以得到显示出明显地高血管再生能力的细胞群体。
[0009] 因此，本发明提供了以下：
[1]通过在含有干细胞因子、白介素-6、FMS-样酪氨酸激酶3配体、血小板生成素和血 管内皮细胞生长因子的无血清培养基中培养来源于骨髓、脐带血或外周血的单核细胞获得 的细胞群体。
[0010] [2]通过在无血清培养基中培养来源于骨髓、脐带血或外周血的单核细胞获得的 细胞群体，其中富集血管内皮祖细胞和抗炎性巨噬细胞。
[0011] [3]上文提及的[1]的细胞群体，其包含血管内皮祖细胞和抗炎性巨噬细胞。
[0012] [4]上文提及的[2]或[3]的细胞群体，其中血管内皮祖细胞是分化的EPC集落形 成细胞。
[0013] [5]上文提及的[2] - [4]中任何项的细胞群体，其中抗炎性巨噬细胞是M2巨噬 细胞。
[0014] [6]生产细胞群体的方法，其中富集血管内皮祖细胞和/或抗炎性巨噬细胞，所述 方法包括在含有干细胞因子、白介素-6、FMS_样酪氨酸激酶3配体、血小板生成素和血管内 皮细胞生长因子的无血清培养基中培养来源于骨髓、脐带血或外周血的单核细胞。
[0015] [7]上文提及的[6]的方法，其中血管内皮祖细胞是分化的EPC集落形成细胞。
[0016] [8]上文提及的[6]或[7]的方法，其中抗炎性巨噬细胞是M2巨噬细胞。
[0017] [9]用于缺血性疾病的治疗剂，其包括上文提及的[1] - [5]中任何项的细胞群 体。
[0018] [10]上文提及的[9]的治疗剂，其中缺血性疾病是通过血管生成治愈的疾病。
[0019] [11]用于难治性溃疡或糖尿病相关疾病的治疗剂，其包括上文提及的[1] - [5] 中任何项的细胞群体。
[0020] 本发明的效果 通过本发明增殖的细胞群体的移植改善了缺血性疾病的血流和坏死改善率。本发明人 进一步研究了这些效果并且得出结论一一本发明可用于定性地和定量地生产内皮谱系细 胞，并且提供了用于针对血管病症(诸如缺血性疾病等）的细胞移植治疗的有用的方法。
[0021] 特别地，根据本发明，即使在具有恶化的血管再生能力的患者，诸如糖尿病患者 中，也可以获得在质量和数量方面均展示了高血管再生能力的细胞群体，并且由于抗炎性 细胞的存在，还在细胞移植中抑制了炎症。因此，本发明作为细胞移植治疗是极其有用的。
[0022] 附图简述 图1显示了通过以2xl06个细胞接种外周血单核细胞（以下称PBMNC)，并且在本发明的 无血清培养基中培养7天获得的细胞(质量和数量细胞（Quality and Quantity Cell);以 下称QQC)相对于在培养起始时间的细胞数量的比例，其中***显示了相对于图中显示的目 标的显著性差异（P〈〇. 001)。
[0023] 图2显示了在左侧的未分化的(小类型)EPC集落，和在右侧的分化的EPC集落，其 中柱条为500 um。
[0024] 图3显示了在接种PBMNC(左侧柱条)和QQC(右侧柱条)后未分化的EPC集落（白 色框）和分化的EPC集落(灰色框）的测量的数量，其中*和*林分别地显示了相对于图中 显示的目标的显著性差异（P〈〇. 05、P〈0.001)。
[0025] 图4显示了在PBMNC培养7天后，分选为⑶34阳性和阴性细胞，在存在从左侧条 柱起CD34阴性、CD34阳性、CD34阳性和阴性细胞的情况下本发明中的无血清培养基中形成 的未分化的EPC集落（白色框）和分化的EPC集落(点框）的测量的数量，其中*和***分别 地显示了相对于图中显示的目标的显著性差异（P〈0. 05、P〈0. 001)。
[0026] 图5A显示了在QQC和PBMNC中每种蛋白质的表达，其通过流式细胞仪测量并且以 表达比例（左侧）或每l〇〇ml外周血中阳性细胞数量的比例（右侧）显示。
[0027] 图5B显示了 PBMNC和QQC的散布图，其基于细胞大小选通至3个群体（即，淋巴细 胞大小、单核细胞大小、大类型细胞大小)，其显示了当进入这些群体的细胞的总量为100% 时各个蛋白质的阳性率(左侧)，和在此情况下QQC后，各个标记物表达细胞相比于全部细胞 (右侧）的％变化。
[0028] 图6显示了在QQC和PBMNC中辅助淋巴细胞（Th)亚群体炎性Thl、抗炎性Th2和 调节性T (T reg)的含量百分比。左侧图表显示了在QQC中含量百分比相对于在PBMNC中 每种Th的含量百分比的比例，并且右图显示了 QQC相对于PBMNC的T亚群含量百分比的实 际数量的增加或减少，其中N=4 - 6。
[0029] 图7显示了当QQc在健康个体(健康的)和糖尿病患者（DM)中执行时，在全部细胞 数量和⑶34阳性细胞数量中变化的比较。*p〈0. 05 图8显示了当QQc在健康个体(健康的)和糖尿病患者（DM)中执行时，抗炎性巨噬细胞 和炎性巨噬细胞的细胞数量中的变化的比较。
[0030] 图9显示了当QQc在健康个体(健康的)和糖尿病患者（DM)中执行时，成熟EPC数 量和具有血管再生能力的细胞集落的数量中的变化的比较。*p〈〇. 05，***p〈0. 001 图10显示了通过定量PCR方法测量的在QQC (黑框)和PBMNC (灰框）中相关基因的表 达，并且以比较GAPDH基因的表达比例显示，其中*、林和分别地显示了相对于图中显 示的目标的显著的差异（P〈〇. 05、p〈0. 01、P〈0. 001)。
[0031] 图11显示了不共培养（白框)、与PBMNC共培养(灰框）和与QQC共培养(黑框）的 人血管内皮细胞（以下为HUVEC)的血管生成，其中HPF显示了高倍视野，并且*和**分别 地显示了关于图中显示的目标的显著性差异（P〈〇. 05、P〈0. 01)。
[0032] 图12显示了测量的PBMNC (白框）和QQC (黑框）的数量，其均使用acLDL-Dil标 记并且在与HUVEC共培养后摄入血管，其中***显示了关于图中显示的目标的显著性差异 (P〈0. 001))。
[0033] 图13显不了与对照小腿相比，使用Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（以下称 HffiM)(白框)、PBMNC (灰框）和QQC (黑框）移植的缺血小鼠的血流量以％的比例，并且在 第21天通过激光多普勒成像分析测量，其中*显示了关于图中显示的目标的显著性差异 (P〈0. 05)，并且N显示了测量的小鼠的数量。
[0034] 图14是以不同颜色对每个阶段显示保肢(小腿保留)得分的柱状图，其中黑色显示 小腿坏死，暗灰色显示足坏死，浅灰色显示脚趾坏死和白色显示完全保留，各自的条柱从左 起显示了頂DM、PBMNC和QQC的移植的结果，并且N显示了测量的样本的数量。
[0035] 图15显示了 EPC随着在细胞接种第8天后在小鼠EPC-CFA中QQ培养的天数的增 殖。随着QQ培养天数的增加，未分化的、分化的EPC集落（pEPC-CFU、dEPC-CFU)逐渐地增 加。图表中的数值显示了每个EPC集落数量。
[0036] 图16显示了在C57BL6/N小鼠小腿缺血模型中通过QQC移植的血流量改善效果。
[0037] 图1