具有缓激肽受体结合活性的多肽及其用图
【技术领域】
[0001]本发明属药学和生物技术领域，涉及蛋白质多肽，具体涉及可与缓激肽受体特异性结合的多肽；更具体的涉及可与缓激肽受体特异性结合的多肽及其在制备治疗脑肿瘤组合药物中的用途。
【背景技术】
[0002]现有技术公开了激肽家族是一类具有强效血管活性和促炎特性的多肽，其包含缓激肽(Bradykinin，BK)、胰激肽(Kallidin，KD)以及它们的活性代谢产物等。上个世纪70年代，Regoli等发现存在两种激肽受体BI和B2 ;研究还显示激肽激活与G蛋白偶联的激肽受体BI和B2，影响激肽释放酶一激肽系统，进而产生多种生理效应。在心血管自我稳定、平滑肌收缩与舒张、炎症以及伤害性感知等方面，激肽的作用已经被人们所揭示。另外，激肽在细胞增殖、纤维化以及血管新生等方面的作用也在不断被人们所了解。作为一种内源性物质，激肽通过激肽释放酶一激肽系统参与了多种疾病的发生发展，如哮喘、过敏反应、类风湿性关节炎、肿瘤、糖尿病、高血压、左心室肥厚、心肌病以及肾脏疾病等。有研究表明，激肽受体在肿瘤微环境中的多种细胞表面高度表达，如肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，激肽受体被激活时会增加血管的渗透性，与细胞的增殖、基质金属蛋白酶的释放以及细胞的侵袭存在关联，因此，有关研究开始将激肽受体作为靶点进行肿瘤的治疗。有关激肽受体拮抗剂被建议用于多种癌症的治疗，尤其是肺癌和前列腺癌，已经有报道证明某些拮抗剂可以诱导肿瘤细胞凋亡或抑制其生长。虽然激肽受体的效应具有危害，但其就像一把双刃剑，当激肽受体激动剂和受体结合后会增加脑血管的通透性，因此有研究利用激肽受体激动剂来辅助治疗脑肿瘤，帮助化疗药物更好的穿过血脑屏障或血脑肿瘤屏障而到达脑肿瘤，起到更好的治疗效果。
[0003]缓激肽是一种内源性多肽，其氨基酸序列为RPPGFSPFR，早在1994年TakanoriInamura和KeithL.Black研究发现低剂量的缓激肽可以选择性开放血脑肿瘤屏障,研究显示，脑肿瘤微环境中的星形胶质细胞和脑肿瘤细胞表面的激肽受体B2的表达显著高于正常脑血管内皮细胞，使得低剂量缓激肽在不影响血脑屏障的前提下选择性开放血脑肿瘤屏障，所述的低剂量缓激肽主要是通过跨细胞和细胞旁两条途径开放血脑肿瘤屏障，首先，低剂量的缓激肽与激肽受体B2结合后使得胞内钙离子水平升高，而钙离子又会与钙调蛋白结合激活一氧化氮合成酶，进而产生一氧化氮，引起细胞内环单磷酸鸟苷水平升高，使得细胞的钙激活性钾通道蛋白的表达增加，促进跨内皮细胞胞饮囊泡的形成；同时，缓激肽还可通过上调质膜微囊蛋白(caveolin)的表达增加胞饮小泡的数量,从而调节血脑肿瘤屏障的通透性；其次，研究还发现缓激肽还可通过影响cAMP/PKA信号通路、RhoA/ROCK信号通路和肿瘤坏死因子一 ct的方式减少紧密连接相关蛋白(如ZO — l、occludin、claudin — 5)和细胞骨架蛋白(F — actin)的表达，从而打开紧密连接，继而增加血脑肿瘤屏障的通透性。
[0004]由于缓激肽在体内容易被降解，因此有研究通过结构改造制备了生物稳定的激肽B2受体激动一RMP-7，利用RMP-7和化疗药物联合给药从而达到辅助治疗脑部肿瘤的效果。然而，到目前为止，由于RMP-7在激肽受体结合活性以及给药剂量等方面还存在一定问题使得研究停滞不前，仍处在二期临床的研究过程中，而且在制备过程中需要用到特殊氨基酸以及还原肽键的技术，因此增加了制备的难度和经济成本。
[0005]另外，天然存在的缓激肽及其衍生物是L构型氨基酸组成的多肽，当L型多肽进入血液后，很容易被血清中的蛋白酶所降解。由于L型多肽在体内稳定性差，导致其作为药物研发存在诸多缺陷。针对上述问题，本领域技术人员通过D构型氨基酸代替L构型氨基酸的方式来提高多肽在体内的稳定性；D构型氨基酸的构型与L构型氨基酸不同，相同序列的D型多肽具有与L型多肽不同的手性，导致其生物活性也可能不同。
[0006]本申请的发明人拟提供一种在体内稳定，且具有缓激肽受体结合活性的有效肽类物质，尤其是在该基础上提供一种能与化疗药物联用的上述肽类物质，以达到提高化疗药物治疗脑部肿瘤的目的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种在体内稳定，且具有缓激肽受体结合活性的有效肽类物质，具体涉及可与缓激肽受体特异性结合的D型多肽及其在制备治疗脑肿瘤的组合药物中的用途。
[0008]本发明的D型多肽可作为脑肿瘤治疗辅助药物，进一步制备治疗脑肿瘤的组合药物，该组合药物能提高化疗药物治疗脑部肿瘤的效果。
[0009]本发明利用多肽序列翻转原理，以内源性缓激肽为模板，设计了三条D型多肽，其氨基酸序列分别为RFPSFGPPR，RFPSFGPPRK和RFPSFGPPRL，分别命名为R1-BK，R1-KD和R1-L-BK，经实验表明，对缓激肽受体具有高亲和性。
[0010]本发明所述的多肽通过固相合成法制备，制备过程中使用的氨基酸为D型氨基酸；
[0011 ] 本发明中，根据缓激肽和受体的结合特性，在D型多肽R1-BK的C端共价连接6 —氨基己酸作为连接分子，同时D构型半胱氨酸作为功能基团引入,与6 —氨基己酸的羧基相连；利用D构型半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺的特异性反应，将RFPSFGPPRXC (其中X代表6 —氨基己酸)与Mal-FITC反应，将FITC标记在多肽分子上，制得标有荧光素的多肽R1-BK-FITC ；
[0012]本发明中，将标有荧光素的多肽进行细胞特异性摄取实验，实验结果表明，C6、HEK和U87等细胞均对R1-BK-FITC有较高的摄取，其中，所述的D型多肽R1-BK，R1-KD和R1-L-BK能抑制C6细胞对R1-BK-FITC的摄取。
[0013]本发明的多肽可用于治疗由于缓激肽和缓激肽的相关肽类所调解、引起或支持的所有病理状态，尤其是在治疗脑肿瘤方面，其可以作为化疗药物的辅助用药，选择性打开血脑肿瘤屏障，可以显著提高药物在脑肿瘤部位的蓄积，减少对正常脑组织的损伤；本发明的实施例中所述的多肽与载紫杉醇的PEG-PLA聚合物胶束联合用药干预原位脑胶质瘤裸鼠，结果显示，能延长原位脑胶质瘤裸鼠的中位生存期，与单独使用紫杉醇聚合物胶束组相比具有极显著性差异。
[0014]与本发明的多肽联合给药的聚合物胶束给药系统，除了 PEG-PLA聚合物胶束，还可以是PEG-DSPE、PEG-PLGA、PEG-PCL以及PEG-聚谷氨酸等形成的聚合物胶束等聚合物胶束系统或脂质体以及纳米粒等；所述的聚合物胶束递药系统不仅包载紫杉醇，还可以包载阿霉素和伊曲康唑等抗肿瘤药物。
【附图说明】
[0015]图1:R1-BK，R1-KD 和 R1-L-BK 的 HPLC 以及 ES1-MS 图谱，其中，
[0016]色谱方法:色谱柱:YMCC185 μ 150X4.6mm ;流动相A:水(含0.1%三氟乙酸);流动相B:乙腈(含0.1 %三氟乙酸)；洗脱程序:2?32分钟5% B-65% B，共45分钟；流速:
0.7ml/ 分钟；柱温:25V ;检测:UV214nm ；
[0017]A 为 R1-BK 的 HPLC 图谱以及 ES1-MS 图谱，Tri bk = 16.1Omin, Mff: 1060.4
[0018]B 为 R1-KD 的 HPLC 图谱以及 ES1-MS 图谱，Tri kd = 15.36min, MW: 1188.6
[0019]C 为 R1-L-BK 的 HPLC 图谱以及 ES1-MS 图谱，Tri l bk = 18.40min, MW: 1173.4。
[0020]图2:C6、U87、HUVEC 和 bEncL 3 细胞对 R1-BK-FITC 的摄取荧光照片，
[0021]其中，
[0022]A为C6细胞对R1-BK-FITC的摄取结果；B为U87细胞对R1-BK-FITC的摄取结果；C为HUVEC细胞对R1-BK-FITC的摄取结果；D为bEnd.3细胞对R1-BK-FITC的摄取结果。
[0023]图3:R1-BK, R1-KD和R1-L-BK抑制C6细胞对R1-BK-FITC摄取的荧光照片和流式检测结果，其中，
[0024]A为C6细胞对R1-BK-FITC的摄取的荧光照片；B、C和D分别为R1-BK，R1-KD和R1-L-BK抑制C6细胞对R1-BK-FITC摄取的荧光照片；E为R1-BK，R1-KD和R1-L-BK抑制C6细胞对R1-BK-FITC摄取的流式检测结果。
[0025]图4 =R1-BK与PEG-PLA胶束联合给药在脑部的药时曲线，其中，
[0026]检测了 9个时间点的脑部所含香豆素6浓度,分别为:5min、10min、15min、30min、lh、2h、4h、8h、12h,每个时间点 3 只小鼠(n = 3) ;Mic