百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2及其编码基因和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及百子莲生长素信号转录调控蛋白及其编码基因和探针，具体涉及一种 百子莲生长素信号转录调控蛋白AUX/IAA2及其编码基因和探针。
【背景技术】
[0002] 内源激素对观赏植物生长发育及观赏性状调控具有重要的作用，生长素在植物体 内是唯一一种具有极性运输特征的内源激素。生长素的含量与分布关系到植株的生长与发 育速度及各器官组织的极性结构与空间形态。生长素的信号传导途径目前研究的较为清 楚，其中Aux/IAA是重要的生长素转录抑制因子，当它与生长素结合时会抑制生长素的转 录，降低生长素含量。
[0003] 体细胞胚胎发生（体胚）是植物分子育种与离体快繁最有效的技术体系，已有研 究表明植物体胚诱导主要依赖于外源生长素调控，且外源生长素类物质毒莠定对单子叶球 根花卉体胚诱导具特效性。百子莲为热带多年生花卉，花量大、花期长、观赏价值高，具有地 下块茎组织。我们前期建立的百子莲体胚体系表明生长素信号对百子莲体胚诱导、体胚形 态、体胚数量与体胚成苗具有决定性作用。另外，应用外源调控物质打断生长素极性运输对 百子莲花期、植株矮化、花序形态均有明显的调控作用。因此，生长素信号对花卉产业化生 产与育种改良工作具有至关重要的作用。
[0004] Aux/IAA的编码基因已从多种植物中克隆出来，包括：拟南芥、水稻、玉米、葡萄、 蓖麻等。但对于观赏植物，尤其是球根花卉中，Aux/IAA的克隆、表达模式及蛋白序列尚不 清楚。目前，未有任何与百子莲Aux/IAA蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于填补百子莲Aux/IAA2基因的克隆、表达模式分析以及百子莲 Aux/IAA2蛋白的空白，提供了一种百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2,本发明还提 供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了百子 莲Aux/IAA2基因转化拟南芥后的生理效应及表达模式，为今后利用基因工程技术对Aux/ IAA2基因表达的时空特性进行调控，从而为体胚发生、株型调控提供了理论依据，具有很大 的应用价值。
[0006] 第一方面，本发明提供了百子莲生长素信号转录调控蛋白，所述蛋白质是由如SEQ IDNO. 4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQIDNO. 4所示的氨基酸序列经过取代、 缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲生长素信号转录调控蛋白特征的蛋白质。
[0007] 优选的，所述蛋白质为SEQIDNO. 4所示氨基酸序列经过1~50个氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0008] 进一步优选的，所述蛋白质为SEQIDNO. 4所示氨基酸序列中1~10个氨基酸被 性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0009] 第二方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0010] 优选的，所述核酸序列具体为：（a)碱基序列如SEQIDNO. 3第1~480位所示； 或（b)与SEQIDNO. 3第1~480位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c)能与 SEQIDNO. 3第1~480位所示的核酸进行杂交的序列。
[0011] 优选的，所述核酸序列具体为SEQIDNO. 3第1~480位所示的核酸序列中1~ 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸形成的 序列。
[0012] 第三方面，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述 核酸序列8~100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码百子 莲Aux/IAA2相关的核酸分子。
[0013] 在本发明中，"分离的DNA"、"纯化的DNA"是指，该DNA或片段已从天然状态下位 于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开， 而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0014] 在本发明中，术语"百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2蛋白编码序列"指 编码具有百子莲Aux/IAA2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO. 3所示的第1~480 位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO. 3所示的第1~480位核苷 酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于 密码子的简并性，所以与SEQIDNO. 3所示的第1~480位核苷酸序列同源性低至约70% 的简并序列也能编码出SEQIDNO. 4所示的序列。该术语还包括与SEQIDNO. 3所示的核 苷酸序列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0015] 该术语还包括能编码天然百子莲Aux/IAA2蛋白的相同功能、SEQIDNO. 3所示序 列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1~90个核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。
[0016] 在本发明中，术语"百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2"指具有百子莲 Aux/IAA2蛋白活性的SEQ ID NO. 4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然百子莲Aux/ IAA2蛋白相同功能的、SEQ ID NO. 4序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）： 通常为1~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或 为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会 改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改 变蛋白质的功能。该术语还包括百子莲Aux/IAA2蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0017] 本发明的百子莲生长素信号转录调控蛋白Aux/IAA2的变异形式包括：同源序列、 保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与百子莲 Aux/IAA2相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用百子莲Aux/IAA2蛋白的抗血清获得 的多肽或蛋白。
[0018] 在本发明中，"百子莲Aux/IAA2保守性变异多肽"指与SEQIDNO. 4所示的氨基酸 序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性 变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0019] 表 1
[0020]
[0021] 发明还包括百子莲AUX/IAA2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与百子莲Aux/IAA2相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差 异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技 术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分 子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似 物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如0、y-氨基酸）的类似物。应理解，本发 明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。
[0022] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。
[0023] 在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析百子莲Aux/IAA2基因产物的表达 模式，即分析百子莲Aux/IAA2基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
[0024] 本发明检测样品中是否存在百子莲Aux/IAA2相关核苷酸序列的检测方法，包括 用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产 物，其中PCR扩增引物对应于百子莲Aux/IAA2相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列 的两侧或中间。引物长度一般为15~50个核苷酸。
[0025] 此外，根据本发明的百子莲Aux/IAA2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源 性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选百子莲Aux/IAA2相关同源基因或同源蛋白。
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