m规格的精滤装置，进一步除去大分子物质。精滤液调节PH值6.5，过300 Da纳滤膜，除去一些小分子及盐类，再过反渗透膜浓缩，得到浓缩液。
[0025](2)浓缩液调节pH值5.5，温度8°C，再加入乙醇，调节乙醇浓度至50%，静置5 h，离心或过滤，收集沉淀。
[0026](3)沉淀用水溶解后过G50葡聚糖凝胶柱，用水洗脱，分别收集洗脱液前50 mL,50 - 100 mL，100 - 200 mL，浓缩后冻干。粉末用水溶解过QuikS印-100中压柱层析柱系统，中压柱自装，中压洗脱条件:流速20 mL/min ;检测波长:215 nm ;进样量:5 mL ;流动相:A栗超纯水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA), B栗初始浓度为10% ；洗脱方式:二元梯度洗脱；洗脱梯度:0.01 min~35 min, 10%~20% ；35.01 min~125 min,20-27% ； 125.01 min~140 min,27%~90% ； 140.01 min~155 min，90%~90%，155.01 min~165min,90^10%o重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰，收集洗脱峰后真空浓缩除去有机溶剂，冷冻干燥，得到初步纯化的酪蛋白磷酸肽。粉末用水溶解，调节PH至5.5，再加入乙醇，调节乙醇浓度至60%，离心取沉淀。
[0027](4)反相硅胶纯化。沉淀溶解再进行反相硅胶纯化，HPLC系统:LC_8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱:服一 0121 ;色谱条件:流速10 mL/min ;检测波长:215 nm ;进样量:I mL ;流动相:A栗超纯水(含0.1% (v/v)TFA)，B栗乙腈(含0.1% (v/v)TFA)，B栗初始浓度为5% ;洗脱方式:二元梯度洗脱；洗脱梯度:0.01 min?25 min，5%~18% ；25.01 min?85 min,18?30% ;85.01 min?95 min，309ir^70% ;95.01 min?120 min，70%~70%，120.01 min?150 min，70°/『5%。重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰。收集洗脱峰后真空浓缩除去有机溶剂，冷冻干燥，得到纯化的酪蛋白磷酸肽。
[0028](5)再次反相硅胶纯化。HPLC系统:LC_15C岛津高效液相色谱仪；色谱柱:C18，Ultimate? AQ_C18，5 μ m，4.6 X 250 mm;色谱条件:流速:1 mL/min ;检测波长:215 nm ；进样量:20 μ L ;流动相:Α栗超纯水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA),B栗初始浓度为10% ;洗脱方式:二元梯度洗脱；洗脱梯度0~15 min, 10%~20% ； 15-50 min,20%~27% ；50.01 min?60 min,90% ；60.01 min?70 min，10%。重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰。收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰后真空浓缩，除去有机溶剂，冷冻干燥，得到酪蛋白磷酸肽单体。
[0029]实施例3:—种高纯度酪蛋白磷酸肽的制备，包括以下步骤:
(I)向烧杯中加纯水600 mL，开搅拌200 rpm，向烧杯中缓慢投入酪蛋白100 g，在50°C条件下搅拌溶解。加入胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为:加酶量为酪蛋白质量的0.2%，反应温度50°C，反应时间2 h，pH 9.0。将温度调节至90°C，保温20 min，进行灭酶灭菌。
[0030](2)调节pH值5.0，过滤除去大分子蛋白。滤液调节pH值4.6，过0.2 μπι规格的精滤装置，进一步除去大分子物质。精滤液调节PH值6.8，过300 Da纳滤膜，除去一些小分子及盐类，再过反渗透膜浓缩，得到浓缩液。
[0031](3)浓缩液调节pH值6.0，温度10°C，再加入乙醇，调节乙醇浓度至60%，静置4 h，
离心或过滤，收集沉淀。
[0032](4)沉淀用水溶解后过GlOO葡聚糖凝胶柱，用水洗脱，分别收集洗脱液前50 mL,50 - 100 mL，100 - 200 mL，浓缩后冻干。粉末用水溶解过QuikS印-100中压柱层析柱系统，中压柱自装，中压洗脱条件:流速20 mL/min ;检测波长:215 nm ;进样量:5 mL ;流动相:A栗超纯水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA), B栗初始浓度为10% ；洗脱方式:二元梯度洗脱；洗脱梯度:0.01 min~35 min, 10%~20% ；35.01 min~125 min,20-27% ； 125.01 min~140 min,27%~90% ； 140.01 min~155 min，90%~90%，155.01 min~165min,90^10%o重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰，收集洗脱峰后真空浓缩除去有机溶剂，冷冻干燥，得到初步纯化的酪蛋白磷酸肽。粉末用水溶解，调节PH至6.0，再加入乙醇，调节乙醇浓度至70%，离心取沉淀。
[0033](5)反相硅胶纯化。沉淀溶解再进行反相硅胶纯化，HPLC系统:LC_8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱:服一 0121 ;色谱条件:流速10 mL/min ;检测波长:215 nm ;进样量:I mL ;流动相:A栗超纯水(含0.1% (v/v)TFA)，B栗乙腈(含0.1% (v/v)TFA)，B栗初始浓度为5% ;洗脱方式:二元梯度洗脱；洗脱梯度:0.01 min?25 min，5%~18% ；25.01 min?85 min,18?30% ;85.01 min?95 min，309ir^70% ;95.01 min?120 min，70%~70%，120.01 min?150 min，70°/『5%。重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰。收集洗脱峰后真空浓缩除去有机溶剂，冷冻干燥，得到纯化的酪蛋白磷酸肽。
[0034](6)再次反相硅胶纯化。HPLC系统:LC_15C岛津高效液相色谱仪；色谱柱:C18，Ultimate? AQ_C18，5 μ m，4.6 X 250 mm;色谱条件:流速:1 mL/min ;检测波长:215 nm ；进样量:20 μ L ;流动相:Α栗超纯水(含0.1% (v/v) TFA), B栗乙腈(含0.1% (v/v) TFA),B栗初始浓度为10% ;洗脱方式:二元梯度洗脱；洗脱梯度0~15 min, 10%~20% ； 15-50 min,20%~27% ；50.01 min?60 min,90% ；60.01 min?70 min，10%。重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰。收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰后真空浓缩，除去有机溶剂，冷冻干燥，得到酪蛋白磷酸肽单体。
[0035]在上述条件下，得到酪蛋白磷酸肽在浓度为0.2g/L时，持钙时间为30 min，得到酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，其分子量分别为1224.12,1082.14,1578.70Da，序列分别为 SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV、IGpSEpSTEDQAMEDIK、ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，酪蛋白磷酸肽的分子量在1000-2000Da之间，有利于人体吸收，酪蛋白磷酸肽单体在水中溶解性好、溶液澄清透明。
【主权项】
1.酪蛋白磷酸肽CPPl、CPP2、CPP3，其分子量分别为1224.12,1082.14、1578.70，CPPl 的序列为 SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，属于 a s2 酪蛋白 68-84 的片段；CPP2的序列为IGpSEpSTEDQAMEDIK，属于α SI酪蛋白59-73的片段；CPP3序列为ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，属于 β 酪蛋白 17-39 的片段。2.一种酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将酪蛋白加水溶解，再加入胰蛋白酶酶解，灭酶杀菌； (2)调节pH值4.0-5.0，过滤，将滤液调节pH值4.0-5.0，过0.2 μ m精滤进一再将精滤液调节PH值6.0-6.8，过纳滤膜，再过反渗透膜； (3)将步骤(2)所得浓缩液调节pH值5.0-6.0，温度5-10°C，再加入乙醇，调节乙醇浓度至40-60%，静置4-6 h，离心或过滤，收集沉淀； (4)将步骤(3)所得沉淀用水溶解后过葡聚糖凝胶柱，收集洗脱液，冻干；粉末溶解过中压柱层析柱，收集洗脱峰，冻干；粉末用水溶解，调节PH至5.0 - 6.0，再加入乙醇，调节乙醇浓度至50%-70%，离心取沉淀； (5)将步骤(4)所得沉淀用制备高效液相色谱仪反相硅胶纯化，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰，真空浓缩，冷冻干燥，得到纯化的酪蛋白磷酸肽； (6)将步骤(5)所得纯化的酪蛋白磷酸肽用高效液相色谱仪进行反相硅胶纯化，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰，真空浓缩，冷冻干燥，得到酪蛋白磷酸肽单体。3.根据权利要求2所述的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，溶解时料水重量比为1:4-6，溶解温度40-50 °C。4.根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，酶解条件为:加酶量为酪蛋白质量的0.1%-0.2%，反应温度40°C_50°C，反应时间I h -2 h，pH7.0_9.0 ο5.根据权利要求2或4所述的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，酶解条件为:加酶量为酪蛋白质量的0.15%，反应温度45°C，反应时间1.5 h，pH 8.0。6.根据权利要求2所述的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，缩液调节PH值5.5，温度8°C和乙醇浓度50%，静置5 h。7.根据权利要求2所述的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述反相硅胶纯化条件为:HPLC系统:LC-8A岛津制备高效液相色谱仪；色谱柱:服-0121 ;色谱条件:流速:10 mL/min ;检测波长:215 nm ;进样量:1 mL ;流动相:A栗超纯水，B栗乙腈，B栗初始浓度为5% ;洗脱方式:二元梯度洗脱；洗脱梯度:0.01 min~25 min，5%~18% ;25.01 min~85 min, 18-30% ；85.01 min~95 min, 30%~70% ；95.01 min~120 min, 70%~70%,120.01 min~150 min，70%~5%，重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰。8.根据权利要求2所述的酪蛋白磷酸肽单体的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述反相硅胶纯化条件为:HPLC系统:LC-15C岛津高效液相色谱仪；色谱柱:C18，Ultimate?AQ-C18，5 μπι，4.6X250 mm;色谱条件:流速:1 mL/min ;检测波长:215 nm ;进样量:20μ L ;流动相:Α栗超纯水，B栗乙腈，B栗初始浓度为5% ;洗脱方式:二元梯度洗脱；洗脱梯度 0~19.5 min, 5%~18% ；19.5—55.5 min, 18%~30% ；55.01 min~65 min, 90% ；65.01 min~75min, 5%，重复进样，收集酪蛋白磷酸肽洗脱峰。
【专利摘要】一种酪蛋白磷酸肽(CPP)单体及其制备方法，其以牛乳中酪蛋白为原料，经过胰蛋白酶酶解、灭酶、精滤、醇沉、离心、过葡聚糖凝胶柱、中压柱层析、反相硅胶纯化、干燥等工艺制备持钙活性高、具有特定序列的酪蛋白磷酸肽CPP1、CPP2、CPP3，其分子量分别为1224.12、1082.14、1578.70，CPP1的序列为SIGpSpSpSEEpSAEVATEEV，属于αs2酪蛋白68-84的片段，CPP2的序列为IGpSEpSTEDQAMEDIK，属于αS1酪蛋白59-73的片段；CPP3序列为ELEELNVPGEIVEpSpSpSEESIT，属于β酪蛋白17-39的片段。本发明所得产品流动性好，25%酪蛋白磷酸肽的水溶液澄清透明，颜色为纯白色粉末；分子量小，有利于人体吸收；磷酸丝氨酸残基多，持钙活性高，能应用于以该特定序列的酪蛋白磷酸肽为活性成分的酪蛋白磷酸肽产品的质量控制。
【IPC分类】C07K1/16, C07K1/34, C07K7/08, C07K14/47, C07K1/20, C12P21/06
【公开号】CN105085651
【申请号】CN201510554374
【发明人】曹庸, 郭斌, 王海波, 李双祁, 刘飞, 吴成顺, 黄慧明, 彭维
【申请人】广州绿萃生物科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月2日