用于检测柯萨奇病毒a16型病毒实心颗粒的单克隆抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及特异性结合柯萨奇病毒A16型病毒实心颗粒的单克隆抗体，或其保守 性变异体或活性片段及其编码核苷酸序列，或其简并性序列。本发明还涉及一种检测柯萨 奇病毒A16型病毒实心颗粒抗原的方法。本发明还涉及该单克隆抗体，或其活性片段或保 守性变异体用于制备诊断、预防和/或治疗柯萨奇病毒A16型感染的药物的用途。
【背景技术】
[0002] 柯萨奇病毒A16型（以下简称CA16)，属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，是 引起手足口病（以下简称HFMD)的主要病原体之一（Rabenau等人，2010,医学微生物学 与免疫学杂志（Med.Microbiol.Immunol) ? 199:45-51;Wang等人，2011，流行病学杂志 (Epidemiology) 22:781-792)。基因组为单股正链RNA。其颗粒为正二十面体结构，无包膜 和突起，直径约30nm，其蛋白外壳由结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4构成，中和表位主要在 VPI、VP2、VP3上，VP4序列高度保守，包裹在衣壳内部。
[0003]HFMD是由肠道病毒引起的传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的 疱疹，个别患者可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒 有20多种（型），其中以CA16和肠道病毒71型（以下简称EV71)最为常见，二者都属于小 核糖核酸病毒科肠道病毒属，同属的还有脊髓灰质炎病毒。HFMD是全球性传染病，世界大 部分地区均有流行报导。美国、澳大利亚、意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿 大、德国等国家经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV71等引起的HFMD疫情。我国自1981 年在上海发现本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广东等十几个省（市）均 有报导。2008年3月在安徽阜阳地区HFMD疫情大爆发，引起社会对该病的广泛关注，近几 年HFMD病例数有逐年上升趋势。为了更好的监控和预防HFMD，卫生部已经将该病列入传染 病防治法规定的丙类传染病。
[0004] CA16病毒是引起HFMD的重要病原体之一，目前CA16疫苗和EV71/CA16联合 疫苗基本都处于临床前研究阶段。相关研究发现CA16病毒存在两种类型的病毒颗粒： 实心颗粒（含RNA，有感染性），空心颗粒（无RNA，无感染性）（Chong等人，2012,PloS one, 2012, 7(11) :e49973)。同属于肠道病毒属的脊髓灰质炎病毒也存在类似现象，S卩存在 实心和空心两种类型的颗粒，并且实心颗粒抗原可激发人体产生中和抗体，是主要的保护 性抗原（Mayer等人，1957,免疫学杂志（JournalofImmunology)78, 435-455.)，因此脊 髓灰质炎疫苗的有效成分是以实心颗粒抗原的含量来衡量的。相关研究提示CA16病毒实 心颗粒也可激发小鼠产生较强的中和抗体，而空心颗粒难于激发小鼠产生较强的中和抗体 (Chong等人，2012,PloSone, 2012, 7(11):e49973)。CA16 实心颗粒抗原可能在CA16 疫苗 有效性方面起着非常重要的作用。开展对CA16病毒实心颗粒抗原检测方面的研究是十分 必要的。目前还没有关于CA16实心颗粒抗原检测方法的报道。因此，获得可特异结合CA16 病毒实心颗粒的单克隆抗体并建立CA16实心颗粒抗原相关检测方法，对CA16疫苗的研发 及质控具有非常重要的意义。
[0005] 要解决的技术问题
[0006] CA16的实心颗粒可激发起更高的中和抗体滴度，CA16病毒实心颗粒抗原可能是 CA16疫苗的主要保护性抗原。目前还没有关于CA16实心颗粒抗原检测方法的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明人经过了深入的研究和创造性的劳动，例如利用不同时间、不同地点分离 到的CA16不同的代表株免疫小鼠，进行单克隆抗体的制备，已制备出100余株杂交瘤细胞 株，其均能够产生对CA16有特异性反应的单抗（单克隆抗体）。发明人通过蔗糖密度梯度 离心纯化方法获得CA16病毒实心颗粒，进一步利用ELISA方法分别检测上述CA16单克隆 抗体与CA16病毒实心颗粒的反应性，筛选与CA16病毒实心颗粒具有高结合活性的单克隆 抗体。最终发现有1株单克隆抗体可特异性结合CA16病毒实心颗粒，即也获得了能够分泌 该可特异性结合CA16病毒实心颗粒的抗体的单克隆细胞系，并进一步建立了可特异性检 测CA16病毒实心颗粒的检测方法，以及证明该单克隆抗体具有制备抗CA16药物或疫苗的 潜力。由此提供了下述发明：
[0008] 本发明提供一种可以特异性结合CA16实心颗粒抗原的单克隆抗体NA10B9,或其 保守型变异体或活性片段；
[0009] 其中，所述保守型变异体或活性片段的氨基酸序列与本发明所述单克隆抗体之氨 基酸序列相比，可以存在一个或多个保守型氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与CA16实 心颗粒抗原特异性结合。
[0010] 具体的，本发明所要求保护的特异性结合CA16实心颗粒抗原的单克隆抗体，或其 保守型变异体或活性片段，其特征为：重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如序列表 中SEQ ID :5、SEQ ID :6、SEQ ID :7所示；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如序 列表中SEQ ID :8、SEQ ID :9、SEQ ID :10所示。
[0011] 更具体的，本发明所要求保护的特异性结合CA16实心颗粒抗原的单克隆抗体，或 其保守型变异体或活性片段，其特征为：具有氨基酸序列为SEQ ID NO :1的重链可变区和 具有氨基酸序列为SEQ ID No :2的轻链可变区。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明 所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，可通过常规蛋白质工程 方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守型变异体或其片段，而仍 能保持与CA16实心颗粒抗原特异性结合。
[0012] 在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列基础上，本 领域普通技术人员也完全知晓可以通过常规的基因工程和蛋白质工程方法，将本发明所述 的重链可变区氨基酸序列和/或轻链可变区氨基酸序列，或将如前述得到的其保守型变异 体和/或其片段，组装成的单链抗体，其仍能保留特异性结合CA16实心颗粒抗原的能力。
[0013] 在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，本领 域普通技术人员也知晓如何装配所述重链可变区氨基酸序列和/或轻链可变区氨基酸序 列或其保守型变异体的嵌合单克隆抗体，或改形单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗 体或抗体片段，其仍保留特异性结合CA16实心颗粒抗原的能力。
[0014] 本发明的另一方面，涉及编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO:3和轻链可变区核苷酸序列SEQIDNO:4,或其简并性序列的核酸分子。
[0015] 本发明又一方面还涉及，上述核苷酸序列经一个或多个核苷酸添加、删除、替换、 修饰等突变后得到的重链可变区核苷酸序列和/或轻链可变区核苷酸序列的变异序列，其 所编码的氨基酸序列组成的单链抗体或嵌合单克隆抗体或改形单克隆抗体或其他人源化 形式的单克隆抗体或抗体片段，仍保留特异性结合CA16实心颗粒抗原的能力。
[0016] 本发明的再一方面涉及一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其 中，所述单克隆抗体为本发明任一方面所述的单克隆抗体，所述偶联部分为选自放射性核 素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种；具体地， 所述单克隆抗体偶联物为融合或偶联的蛋白；在一个实施方案中，所述偶联部分为辣根过 氧化物酶（HRP)。
[0017] 所述偶联可以是MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺 酸脂法等。所述载体有例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白 及其他Y球蛋白等蛋白类载体，另有重组载体可以为多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软 脂酸2S甘油半胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。
[0018] 本发明还涉及一种检测CA16病毒实心颗粒抗原的方法，其包括使用本发明任一 项所述的单克隆抗体或单克隆抗体偶联物或抗体变体或其抗原结合片段来检测CA16病毒 实心颗粒抗原，具体地，所述方法是免疫学检测方法；在一个实施方案中，所述方法是酶联 免疫检测方法（ELISA)。
[0019] 本发明还涉及一种用于检测CA16疫苗中CA16病毒实心颗粒抗原的方法，所述 方法包括使用本发明任一项所述的单克隆抗体或单克隆抗体偶联物或抗体变体或其抗原 结合片段来检测CA16疫苗或包括CA16病毒的多价疫苗中的CA16病毒实心颗粒抗原。 具体地，所述方法是免疫学检测方法；在一个实施方案中，所述方法是酶联免疫检测方法 (ELISA)〇
[0020] 本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的抗体或者本 发明任一项所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上