一株邻二甲苯降解菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境污染物生物强化技术领域，具体涉及一株邻二甲苯降解菌及其应 用。
【背景技术】
[0002] 邻二甲苯是一种重要的有机化工原料，主要用于生产苯酐、染料、杀虫剂、涂料溶 剂以及药物等，其中90%左右用于生产苯酐，2%用于生产溶剂，而仅1%用来生产染料中间 体。邻二甲苯具有较强的毒性，低浓度时能刺激皮肤、粘膜，可以经皮肤渗透入体内；高浓 度时，可以麻醉中枢神经系统，使人神志不清。长期接触可影响肝、肾功能，会引起神经衰 弱综合症。利用物理和化学方法处理邻二甲苯可以达到较好的效果，但其成本高，易造成 二次污染。生物处理法具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广 的优点。因此，采用生物强化的方法，从环境中筛选高效邻二甲苯降解菌，提高原有生物处 理系统对目标污染物的去除效果是消除苯系污染物的重要方法和发展趋势。目前，国内外 学者陆续筛选出一些能够降解苯系物的微生物，包括红球菌)、不动杆菌 d/netoAacterep.)和动胶菌等。CN103451127B申请了一株具 有邻二甲苯降解能力的动胶菌及其应用的专利，该专利从制药废水中分离纯化得到的动胶 菌对邻二甲苯具有较好降解能力，并且能在无机盐培养基中较好降解苯、甲苯、邻二甲苯、 间二甲苯、对二甲苯等苯系污染物，但未发现该菌在实际废水环境中对其中的邻二甲苯和 其他苯系物具有降解能力。本发明的假单胞菌（/kewt/omwassp. )0X5对邻二甲苯的降解 速度快，并且其耐受浓度高达2500mg/L。本发明的0X5不仅能降解焦化废水中的邻二甲苯 和其他苯系物，而且还能降低焦化生化出水中的COD。
【发明内容】
[0003] 本发明旨在解决普通微生物对邻二甲苯降解效率低的问题，目的是提供一株邻二 甲苯降解菌，高效降解邻二甲苯、苯和甲苯等苯系物，实现其对焦化废水的生物强化处理。
[0004] 本发明所述的邻二甲苯降解菌0X5源于武汉平煤武钢联合焦化有限责任公司污 水处理厂内长期受污染的土壤。该菌是以邻二甲苯作为唯一碳源进行生长繁殖，在无机盐 培养基中对土壤中的菌群进行驯化培养，并通过平板划线分离纯化得到。
[0005]其中，无机盐培养基成分为：Na2HPO4 1.5g，KH2PO4 1.5g，（NH4)2SO4 1.0g， MgSO4 .7H20 0.2g，FeSO4 .7H20 0.02g，CaCl2 0.01g，微量元素储备液2mL，蒸馏水定 容至1000mL，pH约为7。所述微量元素储备液的组分为：MnSO4?H2O0?lg，ZnSO4?7H20 0? 12g，H3BO3 0? 07g，Na2MoO4?H2O0? 04g，CuSO4?5H20 0? 02g，CoCl2 0? 04g，蒸馏水定容至 1000 mL0
[0006] 该菌为革兰氏阴性菌，经16SrDNA鉴定为假单胞菌肌/(9術sp.)，编号为 0X5,于2015年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学)，保藏编号为CCTCC N0:M2015415。该菌菌落呈圆形，微凸，菌落四周为乳白色，中间为黄色，表面湿润光滑。生理 生化特性鉴定显示该菌的硝酸盐实验、明胶液化实验和淀粉水解实验为阳性，吲哚实验、产 硫化氢实验、甲基红实验和V-P实验为阴性，能利用邻二甲苯作为唯一碳源进行生长繁殖。
[0007] 该菌较优的培养条件为：温度为35°C，初始pH为7~8,摇床转速为150r/min。
[0008] 本发明还涉及所述假单胞菌sp. ) 0X5用于降解焦化废水中的邻二 甲苯和其他苯系物，降低焦化生化出水中的C0D。
[0009] 与现有技术相比，本发明所述的假单胞菌（/kewt/omwassp. )0X5对邻二甲苯的降 解速度快，耐受浓度高，不仅能高效降解培养基中的邻二甲苯，而且还能有效降解焦化废水 中的邻二甲苯和其他苯系物，对焦化生化出水中的COD也有较好的去除效果。
【附图说明】
[0010] 图1为本发明的菌株0X5的生长与邻二甲苯降解效果关系图； 图2为培养温度对本发明的菌株0X5降解邻二甲苯的影响图； 图3为初始pH值对本发明的菌株0X5降解邻二甲苯的影响图； 图4为摇床转速对本发明的菌株0X5降解邻二甲苯的影响图； 图5为邻二甲苯初始浓度对本发明的菌株0X5降解邻二甲苯的影响图； 图6为本发明的菌株0X5对焦化生化出水中COD的去除效果图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步描述，并非对其保护范围的限 制。
[0012] 实施例1:假单胞菌sp. ) 0X5的分离、鉴定及其对邻二甲苯的降解 性能 1、菌株的分离、纯化 (1)菌种来源 菌源取自武汉平煤武钢联合焦化有限责任公司污水处理厂内长期受污染的土壤，呈黑 色，在不同地点共采集土壤样品3份。
[0013] (2)菌株的分离纯化 将采集的土壤样品加入蒸馏水振荡24h，静置离心后取5ml上清液接种于LB培养基 (蛋白胨1被％，氯化钠lwt%，酵母抽提物0. 5wt%)中，置于30°C、150r/min的恒温摇床富 集培养24h。吸取2mL富集的菌液，离心，弃上清，将菌体接至含有100mg/L邻二甲苯的 无机盐培养基中，于30°C、150r/min下培养，待培养基由澄清变浑浊后，再吸取2mL菌液 转接入新鲜的底物浓度更高的无机盐培养基中相同条件下培养，以此来驯化邻二甲苯降解 菌，无机盐培养基中的邻二甲苯的浓度分别为100,200,400,600,800，1000,2000mg/L。将 底物浓度为2000mg/L时的驯化液按10 3~10 7体积比稀释，取各梯度稀释液分别均匀涂布 于LB平板上，30°C培养24h。挑取长势良好的菌落反复划线纯化，得到单一菌落。对各个单 菌进行邻二甲苯降解实验，确定各菌株的降解能力，将对邻二甲苯降解效果最好的一株菌 编号为0X5,以斜面和甘油保藏菌株。
[0014] 2、菌株的鉴定 (1)邻二甲苯降解菌株0X5的菌落形态特征及生理生化特性 邻二甲苯降解菌株0X5菌落呈圆形，微凸，菌落四周为乳白色，中间为黄色，表面湿润 光滑。生理生化特性鉴定显示该菌的硝酸盐实验、明胶液化实验和淀粉水解实验为阳性，吲 哚实验、产硫化氢实验、甲基红实验和V-P实验为阴性。
[0015] (2)邻二甲苯降解菌株0X5的16SrDNA鉴定 对邻二甲苯降解菌株0X5的16SrDNA基因进行克隆、测序，然后在GenBank中进行Blast比对。结果显示，与其序列相似性达到99%的均为假单胞菌（/kewt/omwassp.)， 其16SrDNA序列如序列表所示。结合菌株的生理生