门多萨假单胞菌nx-1及其在正己烷降解中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株高效新型正己烷降解菌一一门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina)NX_l及其在微生物降解正己烧中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 正己烧（n_hexane，C6H6)是一种低毒、有微弱的特殊气味的无色液体。它是一种化 学溶剂，主要用于丙烯等烯烃聚合时的溶剂、食用植物油的提取剂、橡胶和涂料的溶剂以及 颜料的稀释剂，具有一定的毒性，会通过呼吸道、皮肤等途径进入人体，长期接触可导致人 体出现头痛、头晕、乏力、四肢麻木等慢性中毒症状，严重的可导致晕倒、神志丧失、甚至死 亡。
[0003] 由于正己烷的广泛应用以及长期吸入正己烷会导致慢性中毒，研发出经济又有实 效的处理正己烷的方法已经成为环境污染控制领域的研究热点。正己烷的生物降解已被证 明是可行的，如利用生物滴滤器处理高负荷正己烷废气，已达到70% -90%的降解率。尽管 如此，目前国内对正己烷的生物降解研究较少，很少有报道筛选出以正己烷为唯一碳源的 高效降解菌株。本发明从环境中筛选到一株能高效降解正己烷的菌株，为含该类污染物的 废水和废气的生物净化工程应用奠定基础。
[0004] 微生物是一类种类多，繁殖快，适应性强，代谢能力强的生物体。若能筛选并能分 离出高效降解正己烷的微生物，将正己烷降解成对人体和环境无毒害的物质，这对维持人 类的将抗和生态安全有着深远的意义。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一株新型高效正己烷降解菌一一门多萨假单胞菌NX-I及 其在微生物降解正己烷中的应用。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 门多萨假单胞菌（Pseudomonasmendocina)NX-1，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏日期为2015年3月15日，保藏编号：CCTCCN0:M2015114,地址：中国，武汉，武汉大 学，邮编430072。
[0008] 所述门多萨假单胞菌NX-I的16srDNA的Genebank登录号为KP938962,该菌株的 主要生物学特征为：菌体呈椭圆状，大小为（0.3~0.6)ymX(0.8~2.0)ym，无芽孢，有 鞭毛；菌落呈椭圆状、透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；好氧，氧化酶反 应为阳性，吲哚反应、接触酶反应、柠檬酸盐为阳性；M.R反应、V.P.反应为阴性；糖发酵实 验阴性，革兰氏染色阴性。
[0009] 本发明还涉及所述的门多萨假单胞菌NX-I在微生物降解正己烷中的应用，具体 的，所述的应用为：将门多萨假单胞菌NX-I经种子培养基（优选含终浓度100~400mg/L 正己烷的种子培养基）培养所得的菌液作为酶源，以正己烷为底物，于无机盐培养基中，在 pH= 4 ~10、20°C~40°C，100 ~200rpm条件下（优选pH= 6 ~9、25°C~35°C，100 ~ 200rpm)进行降解反应，实现对正己烷的降解，优选种子培养基为无机盐培养基。
[0010] 所述底物正己烷在无机盐培养基中初始浓度为20~800mg/L无机盐培养基（优 选100~400mg/L)，所述酶源用量以无机盐培养基中OD6。。计为0. 01~0. 03。
[0011] 所述无机盐培养基终浓度组成如下=Na2HPO4 4. 5g/L、KH2PO4I.Og/L、 (NH4) 2S042. 5g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 2g/L、CaCl2 〇? 〇23g/L，微量元素母液lmL/L，pH7. 0,溶 剂为去离子水；所述的微量元素母液浓度组成：FeSO4 ? 7H20I.Og/L、CuSO4 ? 5H20 0. 02g/ L、H3BO3 0? 014g/L、MnSO4 ? 4H20 0? 10g/L、ZnSO4 ? 7H20 0? 10g/L、Na2MoO4 ? 2H20 0? 02g/L、 CoCl2 ? 6H20 0? 02g/L，溶剂为去离子水。
[0012] 本发明所述酶源按如下步骤制备：
[0013] 1)斜面培养：将门多萨假单胞菌NX-I活化接种于R2A固体斜面培养基，30~32°C 培养36~48h，获得斜面菌体，所述R2A固体斜面培养基终浓度组成为：酵母粉0. 50g/L、 干酪素〇? 50g/L、可溶性淀粉0? 50g/L、MgCl2 ? 7H20 0? 05g/L、胰蛋白胨0? 50g/L、葡萄糖 0? 50g/L、丙酮酸钠 0? 30g/L、KH2PO4O. 45g/L，琼脂 15 ~18g/L，pH为 7. 2,溶剂为水；
[0014] 2)种子培养：用接种环挑取步骤（1)获得的斜面菌体接种至含终浓度100~ 400mg/L正己烷的种子培养基培养，30~32°C，培养36~38h，获得菌液；所述种子培养基 为无机盐培养基。
[0015] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株正己烷的高效降解菌一门多 萨假单胞菌NX-1，该菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以正己烷为唯一碳源与 能源生长同时高效降解该底物，能够完全降解高达700mg/L以内的正己烷浓度，并且该菌 株的最适生长温度和pH范围广，在30~37°C，pH为6. 0~9. 0都能较好地降解正己烷，降 解率都能达到80%以上。基于菌株NX-I对于正己烷的高效降解率，使得投资少、运行费用 低、不产生二次污染、操作简单、运行稳定的生物法处理高负荷正己烷废气的方法比费用较 高的物理法和化学法的降解效果更胜一筹。本发明为生物法净化含正己烷废水及废气的工 程应用奠定了基础。 (四）
【附图说明】
[0016] 图1为门多萨假单胞菌NX-I的透射电镜照片；
[0017] 图2为系统发育树；
[0018] 图3为门多萨假单胞菌NX-I的菌体生长、正己烷降解变化曲线图；
[0019] 图4为不同pH值培养液对门多萨假单胞菌NX-I的正己烷降解率的影响柱形图；
[0020] 图5为不同温度对门多萨假单胞菌NX-I的正己烷降解率的影响柱形图；
[0021] 图6为门多萨假单胞菌NX-I对不同初始浓度正己烷的降解曲线图；
[0022] 图7为门多萨假单胞菌NX-I在不同初始正己烷浓度下的生长曲线；
[0023] 图8为门多萨假单胞菌NX-I净化正己烷废水效率曲线图；
[0024] 图9为门多萨假单胞菌NX-I净化正己烷废气效率曲线图。 (五）
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0026]所述无机盐培养基浓度组成为：Na2HPO4?12H20 4. 5g/L、KH2PO4 I. Og/L、（NH4)2SO4 2.5g/L、MgS04*7H20 0.2g/L、CaCl2 0.023g/L，微量元素母液 lmL/L，pH7.0,溶剂为水，所述 微量元素母液组成：FeSO4.7H20 I.0g/L、CuS04.5H20 0? 02g/L、H3B03 0? 014g/L、MnS04.4H20 0? 10g/L、ZnSO4?7H20 0? 10g/L、Na2MoO4?2H20 0? 02g/L、CoCl2?6H20 0? 02g/L，溶剂为去离 子水。
[0027] 所述R2A固体培养基终浓度组成为：酵母粉0. 50g/L、干酪素0. 50g/L、可溶性淀 粉0? 50g/L、MgCl2 ? 7H20 0? 05g/L、胰蛋白胨0? 50g/L、葡萄糖0? 50g/L、丙酮酸钠0? 30g/L、 KH2PO4O. 45g/L，琼月旨15~18g/L，pH为7. 2,溶剂为水。
[0028] 实施例1 :门多萨假单胞菌NX-I的分离与鉴定
[0029] (1)样品采集及驯化
[0030] 初筛：现场采集浙江某制药化工厂污水处理池的活性污泥，经静置沉降2h后， 除去上层清液和悬浮杂质，留下颗粒细小的污泥，取静置后的下层污泥与无机盐培养基 按I:I(v/v)混合接入至污泥驯化罐，总体积为5L，以正己烷为底物作为唯一碳源和能源， (30 土rc)恒温驯化培养，对污泥进行驯化，驯化实验期间对驯化罐进行稳定曝气，控制驯 化罐的pH值维持在7. 0,每天待底物浓度下降至50mg/L以下时，加一次底物使得加入后底 物浓度达到150mg/L(底物投加前取样检测残余底物浓度），间隔3d更换混合培养基，将近 两个月后，驯化的污泥每天可稳定降解150mg/L正己烷，此样品转接入摇瓶进一步富集，获 得驯化样品。
[0031] ⑵将驯化样品按体积浓度10%的接入量接种至50mL无机盐培养基，以正己烷为 底物，初始浓度为l〇5mg/L，30°C、160r/min摇床上培养24h后检测残余底物浓度，待底物降 解率达到80%左右，以体积浓度10%的接入量转接到含相等浓度的正己烷的新鲜无机盐 培养基中，进行多次传代富集后，进行稀释涂布，挑取单菌落，再以正己烷为底物，进行降解 活性测定，分离纯化，获得一株具有正己烷降解活性的菌株NX-I。
[0032] (2)菌株分离与鉴定
[0033] 复筛及纯化：将在无机盐培养基中经过多次传代富集的混合菌液，进行稀释涂布， 依据菌体群落的差异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以正己烷为唯 一碳源和能源的无机盐培养基中，测试降解活性。选择具有正己烷降解能力的单菌落，进一 步分离纯化，获得有正己烷降解活性的纯菌株NX-I。
[0034] 菌株NX-I的形态特征：细胞菌体呈椭圆状，大小为（0. 3~0. 6)ymX(0. 8~2. 0) ym，无芽孢，有鞭毛；菌落呈小圆状、透明、形态饱满、无荧光、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划 线生长。
[0035] 菌株NX-I的生理生化特征为：好氧，氧化酶反应为阳性，吲哚反应、接触酶反应、 柠檬酸盐为阳性;M.R反应、V.P.反应为阴性；糖发酵实验为阴性，革兰氏染色为阴性。
[0036] 测序工作由生工生物工程（上海