一种锦鲤脑细胞系的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株锦鲤脑细胞系的构建方法及在分离病毒方面的应用，属于淡水生物细胞培养应用技术。
【背景技术】
[0002]锦鲤{Cyprinus carp1)又称“绯鲤”、“日本锦鲤”是大型观赏鱼之一，是鲤鱼的变种，属鲤科，鲤属，根据色彩、斑纹等分布情况，锦鲤又分为红白、大正三色、昭和三色等13个品系。锦鲤因其体型好，颜色鲜艳，养殖规模越来越大。随着养殖环境越来越恶劣，锦鲤的各种传染性疾病尤其是锦鲤疱疹病毒病开始广泛传播。锦鲤疱疹病毒病1998年首次爆发在以色列，但在1999年才确认其真正病原是锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)。此后在英国、欧洲大陆、美国、日本也都有暴发。近年来，锦鲤疱疹病毒病的广泛传播，造成锦鲤养殖业巨大的经济损失，已经成为制约锦鲤养殖业可持续发展的重要因素之一。
[0003]流行病学研究表明，KHV传播迅速，可感染任何年龄的锦鲤与鲤，感染KHV的病鱼典型临床症状是行动迟缓、食欲不振、平衡失调、体表多黏液、在皮肤和鳍基部出现出血症状、眼球凹陷、鳃苍白或颜色不规则并伴有中度至严重的鳃坏死，感染后7?1d开始出现死亡，2?3周后死亡率可达100%。该病毒造成病鱼的死亡率极高，疫情难以控制。
[0004]目前，从以色列、美国和日本3个地方分离出的KHV毒株的全基因组序列已被公布，来自以色列和美国的隔离群统称为欧洲株，来自日本的KHV隔离群被命名为亚洲株。
[0005]病毒在细胞水平的分离与培养是研究锦鲤疱疹病毒病防控的基础，是KHV最准确的诊疗方法，但研究表明KHV只能在源自原始宿主细胞中生长，因此，建立来源于锦鲤的细胞系，是进行锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定，研究其致病机理，疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。
[0006]在疫苗的研制上，以色列已经研制出锦鲤疱疹病毒疫苗，并成功上市，由于不同基因型毒株存在差异，疫苗是否适用于中国锦鲤疱疹病毒病的防治也不得而知，因此，建立能够分离目前KHV流行株的来源于锦鲤的细胞系迫在眉睫。
[0007]目前鱼类细胞的原代培养技术基本可以分为两种，组织块培养法和消化培养法。组织块培养法容易产生机械损伤，细胞不易迀出，且迀出的细胞具有选择性。消化法目前常用的是胰酶消化，但胰酶会对一些上皮细胞造成损伤，同时会对纤维和结缔组织无效。迄今为止，通酶消化法制备锦鲤细胞系的文献报道有:董传甫、薛淑群和肖艺均采用组织块分离法建立了锦鲤鳍条细胞系(Virus Research，2011，161: 140-149 ;水产学杂志，2012，25 (4):16-23 ;中国细胞生物学学报2012，34(8): 767-774)，王英英采用消化法建立了一株锦鲤吻端细胞系(Aquaculture，2015，435:310 - 317)，但仍未见锦鲤脑来源细胞系的报道。可见目前需要研究一种有效的锦鲤脑细胞系的构建方法，为后期建立锦鲤其他组织细胞系和进行锦鲤疱疹病毒的研究奠定基础。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种锦鲤脑细胞系的构建方法
本发明的目的在于提供上述方法构建的锦鲤脑细胞系在锦鲤疱疹病毒培养中的应用。
[0009]本发明所采取的技术方案是:
一种锦鲤脑细胞系的构建方法，该方法为:将锦鲤脑组织放入消化液A中进行消化，收集细胞，再加入消化液B中进行消化，收集消化后的细胞进行原代培养和传代培养即可获得锦鲤脑细胞系；
所述消化液A为含0.8?1.2g/L胶原酶和0.7?0.9g/L胰蛋白酶的D-Hanks溶液; 所述消化液B为含0.15?0.25g/L EDTA-4Na的D-Hanks溶液。
[0010]一种锦鲤脑细胞系的构建方法，包括以下步骤:
1)组织消化:将锦鲤脑组织放入消化液A中进行消化，收集细胞，再加入消化液B中进行消化，收集消化后的细胞；
2)原代培养:将上步收集到的细胞加入锦鲤脑细胞培养液制成细胞悬液，在26?28°C,4.5?5.5% CO2条件下进行原代培养；
3)传代培养:当原代培养细胞长满培养瓶底时，去培养液，用胰蛋白酶液消化，消化后去酶液，加入锦鲤脑细胞培养液重悬细胞，将重悬细胞进行传代培养；
所述消化液A为含0.8?1.2g/L胶原酶和0.7?0.9g/L胰蛋白酶的D-Hanks溶液; 所述消化液B为含0.15?0.25g/L EDTA-4Na的D-Hanks溶液。
[0011]进一步的，步骤I)中锦鲤脑组织为剪碎的无菌的锦鲤脑组织。
[0012]进一步的，步骤I)中消化液A消化时的温度为35?38 °C，消化时间为40?50min，每10?17min吹打一次。
[0013]进一步的，步骤I)中消化液B消化的温度为25?30°C，消化时间为2?5min。
[0014]进一步的，在步骤I)原代培养过程中，细胞初次贴壁后，每隔2?3天换一次培养液。
[0015]进一步的，上述锦鲤脑细胞培养液为含有14?16v/v%胎牛血清、9?llng/ml的表皮生长因子、1.8?2.2ng/ml的碱性成纤维样生长因子、18?22mmol/LHEPES、适量青霉素、链霉素和两性霉素B的L-15培养液，pH为7.0?7.4。
[0016]进一步的，步骤3)中胰蛋白酶液中含有0.2?0.3%w/v胰酶-EDTA。
[0017]进一步的，步骤3)中传代培养至8?14代以后，用不含生长因子，不含抗生素，且胎牛血清含量为9?llv/v%的锦鲤脑细胞培养液进行后续的传代培养。
[0018]上述方法制备的锦鲤脑细胞系在培养锦鲤疱疹病毒中的应用。
[0019]本发明的有益效果是:
I)本发明针对锦鲤脑组织细胞的特征，采用胶原酶和胰蛋白酶联合消化法分离脑组织细胞，进行原代培养，继而成功构建了锦鲤脑细胞系，已连续传至100代以上，可提供大量的锦鲤脑来源细胞，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。
[0020]2)本发明构建的锦鲤脑细胞系可以连续传代，经这种方法传代的锦鲤脑细胞系现已传至100代，对锦鲤疱疹病毒(KHV)具有敏感性，接毒后均出现细胞病变(CPE)，电镜观察可以发现增殖的病毒粒子，本发明细胞系可以直接应用于KHV病原特性研究及其疫苗的研制。
【附图说明】
[0021]图1为相差显微镜下传代培养的锦鲤脑细胞系的形态；A为锦鲤脑细胞原代；B为45代锦鲤脑细胞；
图2为锦鲤脑细胞系在不同培养基下的生长曲线；
图3为锦鲤脑细胞系在不同血清浓度下的生长曲线；
图4为锦鲤脑细胞系在不同温度下的生长曲线；
图5为锦鲤脑细胞系感染锦鲤疱疹病毒KHV图片；A为感染KHV病毒之前的锦鲤脑细胞，B为感染KHV病毒72h后锦鲤脑细胞的CPE，C为感染KHV病毒120h后锦鲤脑细胞的CPE, D、E为感染KHV病毒的细胞电镜切片图。
【具体实施方式】
[0022]一种锦鲤脑细胞系的构建方法，该方法为:将锦鲤脑组织放入消化液A中进行消化，收集细胞，再加入消化液B中进行消化，收集消化后的细胞进行原代培养和传代培养即可获得锦鲤脑细胞系；
所述消化液A为含0.8?1.2g/L胶原酶和0.7?0.9g/L胰蛋白酶的D-Hanks溶液; 所述消化液B为含0.15?0.25g/L EDTA-4Na的D-Hanks溶液。
[0023]一种锦鲤脑细胞系的构建方法，包括以下步骤:
1)组织消化:将锦鲤脑组织放入消化液A中进行消化，收集细胞，再加入消化液B中进行消化，收集消化后的细胞；
2)原代培养:将上步收集到的细胞加入锦鲤脑细胞培养液制成细胞悬液，在26?28°C,4.5?5.5% CO2条件下进行原代培养；
3)传代培养:当原代培养细胞长满培养瓶底时，去培养液，用胰蛋白酶液消化，消化后去酶液，加入锦鲤脑细胞培养液重悬细胞，将重悬细胞进行传代培养；
所述消化液A为含0.8?1.2g/L胶原酶和0.7?0.9g/L胰蛋白酶的D-Hanks溶液; 所述消化液B为含0.15?0.25g/L EDTA-4Na的D-Hanks溶液。
[0024]优选的，步骤I)中锦鲤脑组织为剪碎的无菌的锦鲤脑组织。
[0025]优选的，步骤I)中消化液A消化时的温度为35?38°C，消化时间为40?50min，每10?17min吹打一次。
[0026]优选的，步骤I)中消化液B消化的温度为25?30°C，消化时间为2?5min。
[0027]优选的，在步骤I)原代培养过程中，细胞初次贴壁后，每隔2?3天换一次培养液。
[0028]优选的，上述锦鲤脑细胞培养液为含有14?16v/v%胎牛血清、9?llng/ml的表皮生长因子、1.8?2.2ng/ml的碱性成纤维样生长因子、18?22mmol/LHEPES、适量青霉素、链霉素和两性霉素B的L-15培养液，pH为7.0?7.4。
[0029]优选的，步骤3 )中胰蛋白酶液中含有0.2?0.3%w/v胰酶-EDTA。
[0030]优选的，步骤3)中传代培养至8?14代以后，用不含生长因子，不含抗生素，且胎牛血清含量为9?llv/v%的锦鲤脑细胞培养液进行后续的传代培养。
[0031 ] 上述方法制备的锦鲤脑细胞系在培养锦鲤疱疹病毒中的应用。
[0032]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0033]实施例1鲤脑细胞系的构建方法
(I)细胞培养液和组织消化液的配制
I.锦鲤脑细胞培养液的配制:
将L-15培养液(GIBCO)中加入15￥八％胎牛血清(GIBC0)，10ng/ml的表皮生长因子(EGF) (Sigma)和2ng/ml的碱性成纤维样生长因子(bFGF) (Sigma),同时添加100IU/ml青霉素、100 μ g/ml 链霉素、0.25 μ g/ml 两性霉素 B，20mmol/L 的 HEPES, pH 为 7.0-7.4。
[0034]细胞传至10代以后，将锦鲤脑细胞培养液中的胎牛血清添加量减至10%，不添加生长因子和抗生素。
[0035]2.组织消化液的配制
专用组织消化液A:将10mg IV型胶原酶粉末和80