一种启动子元件POsCold8及其使用方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种启动 子元件POsColdS及其使用方法和应用，该启动子元件能够在水稻转基因调控体系中有条 件地驱动目标基因的表达。
【背景技术】
[0002] 水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随 着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而，利用各种方法 来提高水稻单产、改良稻米品质，有着极其重要的意义。将现代生物技术应用到水稻品种改 良中，可以解决一些常规方法难以解决的问题。自九十年代以来，水稻生物技术取得了很大 的发展，一些控制重要农艺性状基因的相继分离和水稻转基因技术的不断完善为用基因工 程技术来改良水稻品种奠定了良好的基础。
[0003]冷胁迫包括冷害和冻害。是指最适温度下限温度的环境对植物的伤害。是众多环 境胁近中对水稻影响尤为突出的一种。芽期、苗期、幼穗期、抽穗期是水稻对低温敏感时期， 苗期遇到冷胁迫时生长缓慢，叶片外观症状表现为秧苗青枯或黄枯，卷曲甚至死亡。在长期 进化过程中，植物形成了复杂的途径来感知外界信号进而通过相应的生理变化来应答环境 胁迫。这是一个多系统的综合生理过程，不仅受环境影响，也受物种本身遗传基因的控制。
[0004] 近年来，随着分子生物学的发展，在水稻耐寒性理论的研究方面取得许多进展，包 括一些关键的耐冷相关基因或QTL相继被克隆。利用这些关键基因，可以有效提高植物对 低温的耐受性。但目前的基因工程操作中，大部分是利用组成型启动子驱动这些关键基因 的表达，所获转基因植株虽然能够表现出较强的低温耐性，但组成型启动子往往会带来一 些不必要的表达，比如造成植株矮小，发育延滞和物质能量浪费，不利于潜在的实际应用推 广。因此，利用冷诱导启动子，特异的激活关键调控基因，将在植物抗冷基因改良中起到重 要作用。
[0005]因此，植物耐冷基因工程迫切需要解决的问题就是要寻找更广泛的种质资源，包 括耐冷基因和相关启动子，从而达到充分挖掘植物本身潜在的耐冷能力的目的。
【发明内容】
[0006]针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离鉴定本底信号低、诱导系数高的新 型启动子或启动子元件，这种启动子对作物基因工程将有着重要的意义。
[0007]为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种所述启动子元件选自下组：
[0008] (a)核苷酸序列包含SEQIDNO: 1所示序列的多核苷酸；
[0009] (b)核苷酸序列与SEQIDNO: 1所示序列的同源性大于等于80%，优选大于等于 85 %，更优选大于等于90 %，更有选大于等于95 %，更优选大于等于多98 %，且具有在低温 诱导条件下特异性表达活性的多核苷酸；
[0010] (C)在SEQIDNO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1~60个，较佳地1~ 50,较佳地1~40,较佳地1~20,更佳地1~6个核苷酸，且具有在低温诱导条件下特异 性表达活性的多核苷酸。
[0011] b)和c)中水稻冷诱导表达启动子序列与SEQIDNo: 1所示的DNA序列具有相同 的功能，即在冷诱导条件下驱动目标基因在植物中表达。
[0012] 序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)的水稻冷诱导表达启动子，本文中称为P0sCold8或启动子P0sCold8。具 体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括 转录起始位点在内的1960bp的DNA序列，具有驱动目标基因在冷诱导条件下表达的功能， 并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
[0013] 优选地，本发明提供的启动子元件P0sCold8的DNA序列为SEQIDNo: 1所示的序 列，即P0sCold8或启动子P0sCold8。其可以用作水稻冷诱导表达启动子。
[0014] 另一方面，本发明提供一种构建物，其特征是，所述构建物含有目的基因以及与目 的基因可操作连接的所述启动子元件。
[0015] 另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征是，所述表达盒从5'至3'依次具有下 述元件：所述启动子元件、基因ORF序列和终止子。
[0016] 另一方面，本发明提供一种载体，其特征是，所述载体含有所述启动子元件或所述 表达盒。
[0017] 另一方面，本发明提供一种利用所述启动子元件构建相应宿主细胞的方法，其特 征是，所述方法包括将所述启动子元件导入宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为根癌农杆菌 细胞。
[0018] 另一方面，本发明提供所述启动子元件、所述构建物以及所述表达盒的用途，其特 征是，所述启动子元件、所述构建物以及所述表达盒用于提高水稻的耐寒性能。
[0019] 另一方面，本发明提供一种构建对寒冷环境具有特异性响应功能的水稻品种的方 法，所述方法包括以下步骤：
[0020] (a)提供一种构建物，所述构建物含有目的基因以及与该目的基因可操作连接的 所述启动子元件；
[0021] (b)将步骤（a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞；
[0022] (C)将步骤（b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而构建出对寒冷环境具有 特异性响应功能的水稻品种。
[0023] 另一方面，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，所述方法包括以下步骤：
[0024] (a)提供下述水稻细胞，所述水稻细胞含有所述载体、或其染色体整合有所述启动 子元件、或其染色体整合有所述表达盒；
[0025] (b)将（a)的水稻细胞再生为水稻植株，从而获得转基因水稻。
[0026] 另一方面，本发明提供一种获取水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎的方法，其特征 是，所述方法包括：利用PCR扩增方法对日本晴水稻DNA中权利要求1所述的启动子元件进 行扩增；
[0027] 扩增获得的DNA序列利用T4连接酶与含有目的基因的预定载体相连接，获得相应 重组载体；
[0028] 利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌；
[0029] 采用农杆菌介导的水稻遗传转化方法利用所述根癌农杆菌将权利要求1所述的 启动子元件以及目的基因转入水稻细胞；
[0030] 利用所述水稻细胞培养水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎。
[0031] 另一方面，本发明提供一种所述启动子元件在培育转基因植物中的应用，其特征 在于，所述应用包括将所述启动子元件连接于载体的待表达的基因序列上游，从而构建重 组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述 应用用于改良植物耐寒，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦；所 述待表达的基因为耐寒基因。
[0032] 本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No: 1中相同）：
[0034]需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列 " TTTATTTTTTTTCAGGTATGCC"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp ; 序列末尾以斜体并加粗表示的序列"GCTTGCTCATTCTGTTTATATC"为获得启动子过程中使用 的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp ;该DNA序列 中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子 既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的 是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发 明的保护范围之内。
[0035] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)P0sCold8基因上游包括转录起始位点在内的1960bp的DNA序列，并将其命 名为启动子P〇sCold8。在具体实施例中，本发明将该序列经酶切后连接到植物双元表达载 体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农 杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得 的转基因水稻进行Gus表达定量检测发现，转基因植株在冷诱导条件下Gus基因表达水平 提高，从而证明该1960bp的序列具有驱动基因在冷诱导条件下特异性表达的活性。
[0036] 本发明所述的启动子元件POsColdS可与植物双元表达载体连接，用于取代组成 型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经 转化后，在冷诱导条件下特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特 性。
[0037] 技术效果
[0038] 本发明所克隆的水稻启动子POsColdS能够调控基因在冷诱导条件下特异性集中 表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启 动子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的特性，从而培育出理想的转基因 植物品种。
【附图说明】
[0039] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0040] 图1为将P0sCold8启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1 中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-P0sCold8示意图，其中示出了利用 P0sCold8启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0041] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0042] 图3以萌发后10天的P0sCold8驱动⑶S报告基因转基因水稻为材料，在10°C下 低温胁迫处理。在胁迫24小时后，通过对报告基因⑶S的定性染色。结果显示，冷处理后， 在根茎叶各个组织中都出现代表⑶S活性的蓝色信号；而未经胁迫处理的植株各组织均没 有检测到⑶S表达；这表明P0sCold8启动子可受低温胁迫显著诱导。（标尺=5mm)
[0043] 图4为4°C低温胁迫的不同时间（0小时/未处理，4小时，8小时，12小时，24小 时，48小时）采集萌发后10天的POsCold:⑶S转基因水稻幼苗植株，提取RNA，通过定量 RT-PCR的方法检查⑶S基因的表达强度来反应P0sCold8的冷诱导活性。结果显示，低温诱 导后，P0sCold8表达强度显著提高，在24小时处理后，活性可达处理前活性的168. 5倍。
【具体实施方式】
[0044] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0045] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均