一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的编码重组猪圆环病毒2型（PCV2)Cap蛋白的基因及该基因编 码的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，还涉及该重组蛋白的制备方法以及应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2型（PCV2)被认为是与许多猪病相关的重要病原体，最初于1996年 在加拿大西部被发现，之后被报道为一种新的综合征，名为仔猪多系统衰竭综合征（PMffS)。 PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是最小的动物病毒之一，基因组全长约I. 7kb，是单股环 状的DNA病毒。有两个比较大的开放阅读框ORFl和0RF2,分别编码Rep和Cap蛋白，R印 主要参与病毒的复制，Cap是病毒的结构蛋白，可以聚集形成病毒的二十面体衣壳。PCV2Cap 蛋白免疫原性高、可与感染PCV2的猪血清反应，因此，Cap蛋白可用作设计新型PCV2疫苗 的抗原分子，近年来成为疫苗研究的最主要靶抗原。 近年来，原核和真核表达系统被用于表达Cap蛋白，用于抗PCV2动物免疫。在真核表达 系统中，重组蛋白最重要的特性是能通过自我组装形成病毒样颗粒（VLPs)，重组Cap蛋白 最先在杆状病毒表达系统中成功表达，并已经开放成功重组杆状病毒亚单位疫苗。然而，任 何真核表达系统表达蛋白的成本都很高，在应用上受到限制，而原核表达系统则正好相反， 成本低廉。但原核表达也存在难点，例如大肠杆菌表达Cap蛋白最大的困难在于Cap蛋白 的N端是一段富含碱性氨基酸的高度保守序列，1-41位氨基酸是Cap蛋白的核定位信号肽 序列（NLS)，NLS上的特异性氨基酸使Cap蛋白表达水平很低，即使将Cap基因与GST、MBP 等蛋白融合，其表达水平仍然很低。此外，Cap蛋白大肠杆菌系统表达产物多以包涵体形式 存在，使应用进一步受到限制。
[0003]细胞分泌型多肽（CPPs)，或称为蛋白传输域（PTDs)、细胞穿透肽 (cellpenetratingpeptides)、细胞穿膜肽，是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，可 有效提高不同生物分子的细胞间转移，包括质粒DNA、寡核苷酸、短干扰RNA(SiRNA)、多肽 核苷酸（PNA)、蛋白和多肽，以及脂质体纳米颗粒在体内体外转移进细胞或组织，可作为将 具有生物学活性的分子转运进入细胞的工具。目前没有将CPPs与Cap蛋白进行融合的报 道出现。
【发明内容】
[0004] 本发明针对重组Cap蛋白的存在形态以及原核表达存在的难点，提供了一种新的 编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因、含有该基因的重组质粒和重组工程菌，该重组工 程菌能表达可溶性重组PCV2Cap蛋白。 本发明还提供了上述基因编码表达的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，该蛋白具有很好 的抗原性和免疫原性，且为可溶性蛋白，更便于应用。 本发明还提供了制备上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，该方法操作简便，易于 实现。 本发明还提供了以上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白为有效成分的亚单位疫苗和PCV2 抗体诊断试剂盒。
[0005] 本发明为了提高Cap蛋白的表达水平以及存在形态，将Cap蛋白N端的前10个氨 基酸去除，同时与细胞分泌型多肽进行融合，得到融合蛋白，或者也可以称为重组PCV2Cap 蛋白、重组蛋白、重组Cap蛋白。该重组PCV2Cap蛋白是由重组基因表达获得，根据设计的 特殊引物序列，扩增出重组基因，重组基因是由缺失的Cap基因与细胞分泌型多肽基因拼 接得到的，缺失的Cap基因是缺失编码NLS中N端前10个氨基酸的基因序列的Cap蛋白基 因。将该重组基因插入质粒获得重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌得到重组工程菌，重组 工程菌表达得到可溶性重组PCV2Cap蛋白。细胞分泌型多肽CPPs包括蛋白型（P)、嵌合型 (C)和合成型（S)。本发明使用MPG、ppTG20、TAT三种细胞分泌型多肽进行研究，MPG属于 C型，C型CPPs部分源于自然多肽或蛋白，如蛋白的信号序列可被受体蛋白识别，以协助未 成熟的蛋白经翻译后转移到细胞间组分的膜上。MPG嵌合了HIVgp41的融合序列和SV40T 抗原的NLS，其基因序列为GGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGG TCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTT，氨基酸序列为：617-厶1&-1^11-?116-1^11-617-?116-1^11-617-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val〇ppTG20 属于S型，是一种a螺旋S型CPPs，其基因序列为：GGTCTGITCCGAGCACTGCTGCGACTGCTGCG ATCTCTGTGGCGACTGCTGCTGCGAGCA，氨基酸序列为：Gly-Leu-Phe-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu -Leu-Arg-Ser-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ala。TAT属于P型，是涉及HIV复制的氨基 酸86-102位点的转录激活因子，基因序列为：TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA，氨基 酸序列为：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。以缺失的Cap基因为模板， 分别与MPG、ppTG20、TAT基因拼接，得到重组基因，将所得重组基因分别进行原核表达得到 三种重组PCV2Cap蛋白。经实验验证，仅有与MPG拼接形成的MPG-Cap(简称MrCap)重组 蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，且可溶性蛋白表达量高，实现了Cap蛋白目的基因可溶 性表达。而ppTG20-Cap(简称prCap)和TAT-Cap(简称TrCap)重组蛋白主要以包涵体的 形式存在，可溶性蛋白表达量低，应用性不强。 本发明具体技术方案如下：
[0006] 一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因（简称重组PCV2Cap基因），该基因 是在缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列的N端融合细胞分泌型多肽MPG的基因序列 所形成的，所述缺失的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因序列缺失的是编码NLS中N端前10个 氨基酸的基因序列。 进一步的，本发明编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的序列如SEQIDNO. 1所 示。在知道了该编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的情况下，可以通过PCR扩增的 方式得到该基因。 本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒是将上述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋 白的基因插入pET28a(+)质粒中构建而得。 本发明还提供了一种重组工程菌，该重组工程菌是将上述重组质粒转化入大肠杆菌中 而得。所述大肠杆菌可以为大肠杆菌BL21。
[0007] 本发明还提供了扩增上述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因的引物，依次 以下述a、b、c三对引物进行三次PCR扩增可以得到上述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白 的基因序列（共进行三次PCR扩增，每次扩增依次以a、b、c作为引物，上一次扩增得到的基 因片段为下一次扩增的DNA模板，最后一次扩增得到编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的 全长基因）；
本发明重组猪圆环病毒2型Cap蛋白可以由上述重组工程菌在IPTG诱导下表达而得。
[0009]本发明还提供了上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法，步骤包括：将重组 工程菌进行培养，待菌液0D600达到0. 8-1. 0时，加入终浓度为I.Ommol/L的IPTG，继续培 养5h;培养结束后离心收集细菌，用PBS重悬，超声破碎收集上清液，重组猪圆环病毒2型 Cap蛋白存在于上清液中。 上述制备方法中，进一步的，将所得上清液用硫酸铵进行纯化，可获得纯化的重组猪圆 环病毒2型Cap蛋白。
[0010] 本发明还提供了一种新的亚单位疫苗或PCV2抗体诊断试剂盒，该亚单位疫苗或 PCV2抗体诊断试剂盒中含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。 上述亚单位疫苗中，含有8ml重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的培养上清液或8ml纯化 的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白，该培养上清液或纯化的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白按 照上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备方法获得。
[0011] 本发明还提供了上述亚单位疫苗的制备方法，步骤包括： (1) 将重组工程菌培养至菌液0D600达到0. 8-1. 0,然后加入终浓度为I.Ommol/L的 IPTG，继续培养5h;培养结束后离心收集细菌，用PBS重悬，超声破碎收集溶有重组猪圆环 病毒2型Cap蛋白的上清液，或者将该上清液进一步用硫酸铵纯化，得纯化的重组猪圆环病 毒2型Cap蛋白； (2) 取8ml上述溶有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的上清液或8ml纯化的重组猪圆环 病毒2型Cap蛋白，用PBS稀释至500yg/mL，然后加入2ml佐剂，得亚单位疫苗。 所述佐剂可以为CPH佐剂，其主要成分为卡波姆和生育酚。
[0012] 为了获得可溶性重组PCV2Cap蛋白，本发明采用PCR方法将MPG、ppTG20、TAT等穿 膜肽分别与NLS部分缺失的Cap蛋白N端基因融合构建成新的基因分子，然后克隆至大肠 杆菌表达载体pET28a，获得重组质粒，转化至大肠杆菌BL21得重组工程菌，重组工程菌用 IPTG诱导表达获得可溶性重组PCV2Cap蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定，本发明 所得重组蛋白MrCap、prCap、TrCap大小分别为33ku、32ku和31ku，其中，MrCap大部分存在 于细菌裂解上清液中，为可溶性的，可溶性蛋白表达量明显高于PrCap和TrCap重组蛋白可 溶性表达量。将MrCap大肠杆菌诱导表达菌体裂解液离心取出上清液，经硫酸铵沉淀法纯 化后，可以获得纯化的MrCap重组蛋白（CMrCap)。经琼脂扩散试验（AGP)和夹心ELISA检 测，该重组蛋白MrCap具有较好PCV2抗原性，将MrCap和CMrCap分别与CPH水佐剂混合制 成疫苗，选择4-6周龄雌性ICR小白鼠免疫，首免后第3和6周采血，测量PCV2抗体水平， 结果为：2种不同疫苗免疫后均可诱导机体产生PCV2抗体，其中，CMrCap-CPH疫苗组中和抗 体水平达1 :75,证明其具有较高的抗原性和免疫原性，为PCV2抗体检测试剂盒和亚单位疫 苗的研制奠定了基础。
【附图说明】
[0013] 图1.重组PCV2Cap蛋白基因设计与构建示意图。 图2.重组质粒双酶切鉴定图，其中：1:DL2000DNA标准分子量；2-4:pET28a-MrCap、pET28a-prCap、pET28a-TrCap重组质粒双酶切产物。 图3.重组蛋白诱导产物SDS-PAGE分析（A)及Western-blot(B)检测图，其中：M:蛋白 标样；l:BL/pET28a(+)菌体诱导产物；2